2. Nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu
2.3. Phương pháp xử lý các kết quả thực nghiệm
2.3.1. Độ lặp lại
Độ lặp lại phản ánh độ chính xác của phép phân tích. Độ lặp lại là độ chụm trong điều kiện lặp lại. Điều kiện mà tại đó các kết quả thử nghiệm độc lập nhận được với cùng một phương pháp trên những mẫu thử nghiệm giống hệt nhau, trong cùng một phòng thí nghiệm bởi cùng người thao tác, sử dụng cùng một thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn.
Cách xác định độ lặp lại:
- Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 10 lần trên cùng một mẫu. Mẫu phân tích là mẫu thử hoặc mẫu thử chuẩn.
- Tiến hành ở các nồng độ khác nhau (trung bình, thấp nhất, cao) trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ lặp lại 10 lần. Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các thông số sau:
SD RSD% = CV% = SD X ×100 Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn. n: số lần thử nghiệm thứ i.
Xi: giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i.
X : giá trị trung bình của các lần thử nghiệm xi. RSD%: độ lệch chuẩn tương đối.
CV%: hệ số biến thiên.
Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo chuẩn AOAC được thể hiện ở bảng 2.2.
27
Bảng 2.2. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) TT Hàm lượng % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2.3.2. Độ thu hồi (H%)
Độ thu hồi phản ánh độ đúng của phép phân tích. Cách xác định: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó. Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần lặp lại.
Công thức tính độ thu hồi:
H% = Trong đó:
H%: Độ thu hồi của phương pháp (%). C1: Nồng độ đo được của mẫu thêm chuẩn.
C2: Nồng độ đo được của mẫu không thêm chuẩn. C: Nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào.
Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo chuẩn AOAC và theo hội đồng châu Âu được thể hiện ở bảng 2.3 và 2.4.
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) TT Hàm lượng % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bảng 2.4. Độ thu hồi chấp nhận (theo hội đồng Châu Âu)
TT
1 2 3
2.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Độ nhạy của phương pháp phân tích được phản ánh qua giới hạn phát hiện. Giới hạn phát hiện là khối lượng (nồng độ) nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu có thể phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu trắng (hay tín hiệu nền). Có nhiều quan điểm khác nhau về cách xác định giới hạn phát hiện như theo quy định của IUPAC, theo cơ quan quản lý môi trường của Mỹ EPA và phổ biến nhất là cách xác định giới hạn phát hiện (LOD) theo quy tắc 3 . Theo quy tắc này, LOD được quy ước là nồng độ của chất phân tích cho tín hiệu gấp 3 lần độ lệch của đường nền. Hay giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng).
29
Dựa trên độ lệch chuẩn
Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất phân tích). Phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn. Độ lệch chuẩn này phải khác 0.
Công thức:
xoi: Nồng độ mẫu trắng mỗi lần đo SD0: Độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)
Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền. Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp sắc ký, điện di. Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp, ở đó còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3- 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền. Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của píc tại nửa chiều cao. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3
30
Hình 2.6. Xác định LOD bằng cách tính S/N Dựa trên đường chuẩn
Cách này chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn. LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo.
=
Trong đó:
SD : Độ lệch chuẩn của tín hiệu, có thể chấp nhận là độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc của dung dịch chuẩn có nồng độ thấp gần tới LOD
a : Độ dốc của đường chuẩn
2.3.4. Giới hạn định lượng (LOQ)2.3.4.1. Định nghĩa 2.3.4.1. Định nghĩa
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng. Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp.
2.3.4.2. Cách xác định
Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật. LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính.
Đồ thị mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính được thể hiện ở hình 2.7.
Hình 2.7. Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính
Xác định LOQ dựa trên độ lệch chuẩn
Có hai trường hợp như trong phần tính LOD là thực hiện trên mẫu trắng và thực hiện trên mẫu thử. Các công thức tính toán như sau:
- Tính trên mẫu trắng:
- Tính trên mẫu thử: LOQ = 10.SD
Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền. Cách tính toán hoàn toàn tương tự như trong phần tính LOD. LOQ được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10.
Dựa trên đường chuẩn
Cách tính tương tự như trong phần LOD, nhưng theo công thức sau:
LOQ = 10∗ = 10LOD
3
Lưu ý: Ngoài việc tính toán như trên cần quan tâm đến độ lặp lại tại LOQ, tùy theo mỗi phương pháp, giá trị RSD% cần phải đạt được theo một mức yêu cầu nào đó.
32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu khảo sát các điều kiện đo trong các phép đo chì, kẽm, cadimi
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử F-AAS có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đo có thể dẫn đến những hướng sau:
- Làm giảm độ hấp thụ của vạch phổ của chất phân tích do tạo hợp chất bền nhiệt, khó hóa hơi và khó nguyên tử hóa mẫu.
- Làm tăng độ hấp thụ vạch phổ do tạo các hợp chất dễ hóa hơi và dễ nguyên tử hóa hay do hạn chế ảnh hưởng của sự ion hóa và kích thích phổ phát xạ của nguyên tố phân tích.
- Tăng độ hấp thụ vạch phổ khi nguyên tố phân tích tồn tại trong nền của mẫu là những hợp chất khó hóa hơi. Khi đó các chất này như một chất mang cho sự hóa hơi nguyên tố phân tích, nó làm hóa hơi với hiệu suất cao.
- Giảm độ hấp thụ vạch phổ khi nguyên tố phân tích trong nền của mẫu là những hợp chất bền nhiệt, khó hóa hơi. Lúc này các nguyên tố nền kìm hãm sự hóa hơi các nguyên tố phân tích.
Các điều kiện đo AAS đối với chì, kẽm và cadimi đã được nghiên cứu và lựa chọn:
Các thông số đo AAS rất quan trọng, phụ thuộc vào mỗi hệ máy đo, các điều kiện tiến hành phân tích. Đối với mẫu chứa trong dung dịch nước cất deion chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tốc độ dẫn khí ảnh hưởng tới độ hấp thụ quang, còn các thông số đo khác theo đề nghị của nhà cung cấp máy.
Bằng cách thay đổi tốc độ dẫn khí C2H2 từ 1,5 đến 4 (l/phút) và tốc độ không khí từ 12; 13,5; 15,5; 17 (l/phút) và chọn tốc độ dẫn khí tối ưu là tốc độ dẫn khí mà tại đó độ hấp thụ cực đại và độ lặp lại tốt. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
33
Bảng 3.1. Các điều kiện tiến hành phân tích Pb2+, Zn2+, Cd2+ theo kỹ thuật F- AAS
Tên máy đo
Kiểu nguyên tử hóa
Công suất đèn catot rỗng (mA) λ (nm)
Tốc độ dẫn khí C2H2 (l/phút) Tốc độ không khí (l/phút) Độ rỗng khe đo (nm)
Thời gian nguyên tử hóa (giây)
3.2. Xây dựng đường chuẩn của chì
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đường chuẩn tại các vùng nồng độ khác nhau 0,1 – 0,4ppm; 0,2 – 0,8ppm; 1,0 – 2,0ppm.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 và các hình ảnh 3.1 - 3.6:
Bảng 3.2. Sự thay đổi độ hấp thụ quang theo nồng độ Pb2+
Vùng nồng độ 0,1 – 0,4ppm Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs) Vùng nồng độ 0,2 – 0,8ppm Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs)
34
Vùng nồng độ 1,0 – 2,0ppm
Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ
(Abs)
Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn Pb2+ vùng nồng độ 0,1 – 0,4ppm
A
b
s
Hình 3.3. Phương trình đường chuẩn Pb2+ vùng nồng độ 0,2 – 0,8ppm
A
b
s
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn Pb2+ vùng nồng độ 0,2 – 0,8ppm
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn Pb2+ vùng nồng độ 1,0 – 2,0ppm
36
A
b
s
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn Pb2+ vùng nồng độ 1,0 – 2,0ppm
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đường chuẩn của kẽm trong các vùng nồng độ khác nhau 0,05 – 0,5ppm; 0,5 – 2,0ppm.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và các hình 3.7 - 3.9:
Bảng 3.3. Sự thay đổi độ hấp thụ quang theo nồng độ Zn2+
Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs) Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs)
37
Hình 3.7. Phương trình đường chuẩn Zn2+ vùng nồng độ 0,05 – 0,5ppm A bs Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn Zn2+ vùng nồng độ 0,05 – 0,5ppm A bs Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn Zn2+ vùng nồng độ 0,5 – 2,0ppm 38
3.4. Xây dựng đường chuẩn của cadimi
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đường chuẩn trong vùng nồng độ 0,25-2,0 ppm của Cd2+. Kết quả nghiên cứu thu được ở bảng 3.4 và các hình 3.10, 3.11.
Bảng 3.4. Sự thay đổi độ hấp thụ quang theo nồng độ Cd2+
Vùng nồng độ 0,25 – 2,0ppm Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs) A bs 39
3.5. Kết quả đo định lượng chì, kẽm, cadimi trong các mẫu son môi
Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị như ở mục 2.2, chúng tôi tiến hành đo phổ hấp thụ nguyên tử trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 240FS. Dựa vào giá trị độ hấp thụ và đường chuẩn đã xây dựng, xác định được nồng độ các ion của chì, kẽm và cadimi trong các dung dịch mẫu đã qua xử lý.
Hàm lượng của chất phân tích được tính theo công thức:
X C x V m Trong đó:
X: hàm lượng chì, kẽm, cadimi trong thể tích mẫu đem đo (mg/g hoặc µg/g). Cx: nồng độ chất phân tích trong mẫu đo phổ tìm được theo đường chuẩn (mg/l hoặc µg/l).
V: thể tích dung dịch mẫu (50ml hay 0,05lít). m: lượng mẫu phân tích (g)
Kết quả phân tích hàm lượng Zn2+, Pb2+, Cd2+ trong son môi thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả tính toán hàm lượng chì, kẽm, cadimi trong các mẫu mỹ phẩm son môi
Tên mẫu son STT 1 Nars 2 Locean 3 Nyx 4 Amok
5 Maybeline
6 Jakelin
40
7 12h lipcolor 8 Son gấc 9 Thêm chuẩn 10 Mẫu trắng Nhận xét:
Hàm lượng Pb trong mỹ phẩm không được vượt quá 20 ppm (0,02 mg/g) (theo thông tư số 06/2011, thông tư Quy định về quản lý mỹ phẩm của Bộ y tế [10]). Hàm lượng Zn trong mỹ phẩm không được vượt quá 1% (10 mg/g) (theo phụ lục III, hiệp định ASEAN về mỹ phẩm [8]).
Cd không được phép có trong sản phẩm mỹ phẩm (theo công văn số 3716/QLD của cục quản lý dược Việt nam, Bộ y tế [1]).
Với kết quả phân tích thể hiện trong bảng 3.5, nhận thấy chỉ có hàm lượng Pb trong mẫu son Nars là vượt ngưỡng cho phép.
3.6. Đánh giá phương pháp
3.6.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp phân tích thể hiện qua các giá trị của độ lệch chuẩn của 10 phép đo lặp lại tại các vùng nồng độ khác nhau.
Kết quả đo độ lặp lại của mẫu chuẩn và mẫu thực xác định Pb, Zn,Cd thể hiện ở các bảng 3.6 và 3.7 sau:
Bảng 3.6. Kết quả của phép đo lặp lại ở vùng nồng độ cao
Lần 1 2 3 4
41
5 6 7 8 9 SD RSD%
Bảng 3.7. Kết quả của phép đo lặp lại ở vùng nồng độ thấp
Lần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SD RSD%
Nhận xét: So với tiêu chuẩn AOAC ở bảng 2.2 thì RSD% ở vùng nồng độ thấp và vùng nồng độ cao đều trong ngưỡng cho phép.
3.6.2. Tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của chì
Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện Pb2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn:
LOD =3∗SD =3∗1,5∗10−4 = 0,022 (ppm)
0,02007
Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng Pb2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn: LOQ =
3.6.3. Tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của kẽm
Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện Zn2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn:
LOD =3∗SD =3∗9,4∗10−4 = 0,013 (ppm)
0,22527
Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng Zn2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn:
LOQ =
3.6.4. Tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của cadimi
Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện Cd2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn:
LOD =3∗SD =3∗1,2∗10−3 = 0,032 (ppm)
0,12066
Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng Cd2+ bằng phép đo F-AAS theo đường chuẩn: LOQ =
3.6.5. Đánh giá hiệu suất thu hồi
Để đánh giá độ đúng của quá trình phân tích, phương pháp phân tích chúng tôi tiến hành xác định hiệu suất thu hồi bằng cách thêm một lượng dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ vào mẫu MS5, sau đó xác định hàm lượng sắt, chì trong mẫu thêm chuẩn này. Quy trình được tiến hành như ở mục 2.2.2.2.
43
Hiệu suất thu hồi Pb2+ được tính: H = C C Tông
Trong đó: Nồng độ của Pb2+ trong mẫu MS5 thu được là: C1= 0,214 (ppm)
Nồng độ Pb2+ thêm vào mẫu MS5, thể tích thêm là 40μl Pb2+ 1000ppm định mức thành 50ml là:
0,04∗1000
CPb thêm = = 0,8 (ppm)
Mẫu MS5 có thêm chuẩn chì, đã biết nồng độ trước:
CTổng = CPbthêm + C1 = 0,214 + 0,8 = 1,014(ppm)
Mẫu MS5 có thêm chì chuẩn, đo bằng AAS, với nồng độ 0,923ppm Vậy hiệu suất thu hồi của Pb2+ là:
H =1,0140,923= 91,02%
Tương tự, ta có hiệu suất thu hồi Zn2+ được tính theo công thức:
H
= C
Trong đó: Nồng độ của Zn2+ trong mẫu MS5 thu được là: C1= 1,432 – 0,268 = 1,167 (ppm)
Nồng độ Zn2+ thêm vào mẫu MS5, thể tích thêm là 60μl Zn2+ 1000ppm định mức thành 50ml:
CPbthêm =0,06∗1000 = 1,2 (ppm)
50
Nồng độ thực trong mẫu thêm chuẩn của Zn2+ là:
CTổng = CPbthêm + C1 = 1,2 + 1,167 = 2,367 (ppm)
44