Xác nhận giá trị sử dụng bằng việc đánh giá các thông số sau:
Độ đặc hiệu
Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ.
Khoảng tuyến tính.
Độ lặp lại
Độ thu hồi
2.2.4. Xác định hàm lượng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân có mặt trên thị trường
Lấy mẫu tại địa bàn Hà Nội.
Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích và đánh giá kết quả.
2.3. Thiết bị phân tích
Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ gồm hệ thống sắc ký lỏng LC20AD Shimadzu kết hợp với khối phổ 5500QQQ, AB SCIEX, USA (hình 2.1).
Máy đồng nhất mẫu, Phillips.
Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.
Máy lắc xoáy, IKA.
2.4. Dụng cụ phân tích Micropipet có thể tích điều chỉnh đƣợc 20-200µL, 100-1000µL và 1000- Micropipet có thể tích điều chỉnh đƣợc 20-200µL, 100-1000µL và 1000- 5000µL. Cốc cân có mỏ Bình định mức: 5, 10, 20, 25, 50 và 100mL. Ống ly tâm 50 mL. Ống ly tâm 15 mL Vial loại 1,8 mL. Màng lọc mẫu 0,22µm.
Cột chiết pha rắn SPE – HLB (Waters)
Cột chiết pha rắn SPE – SCX (Waters)
Than hoạt tính (GCB) (Agilent, US)
2.5. Dung môi, hóa chất
Hoá chất sử dụng đều thuộc cấp độ LC-MS
2.5.1. Dung môi
Methanol (Merck)
Acetonitrile (Merck)
Acetone (Merck)
Ammoni hydroxide (Merck)
Ammoni acetate (Merck)
Acid formic (Merck)
Chloroform (Merck)
Muối Magie sulfate (Merck)
Muối natri clorua (Merck)
Nƣớc deion
2.5.2. Chất chuẩn
Chuẩn Sibutramine hydrochloride (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%.
Chuẩn Desmethyl sibutramine (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%.
Chuẩn Didesmethyl sibutramine (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%.
2.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Cân chính xác khoảng 0,0125g ± 0,0001 từng chuẩn gốc SB, DSB và DDSB vào cốc cân có mỏ riêng biệt. Thêm 5 mL MeOH, hòa tan chuẩn, chuyển lần lƣợt vào các bình định mức 25mL, tráng rửa cốc cân đựng chuẩn nhiều lần, gộp dịch và định mức đến vạch bằng methanol, dung dịch các chuẩn gốc thu đƣợc có nồng độ 500 µg/mL. Bảo quản 12 tháng ở nhiệt độ 4oC.
* Dung dịch chuẩn trung gian 5 µg/mL
Hút chính xác 0,1 mL từng dung dịch chuẩn gốc 500 µg/mL bằng pipet, lần lƣợt cho vào các bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều, định mức tới vạch. Dung dịch chuẩn trung gian của từng chuẩn có nồng độ 5 µg/mL. Bảo quản ở 4oC, sử dụng trong 1 tháng.
* Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc
Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp đƣợc pha chế từ các chuẩn đơn trung gian. Hút chính xác 1 mL lần lƣợt từng chuẩn đơn trung gian vào bình định mức 50 mL, thêm 10 mL MeOH, lắc đều, định mức tới vạch. Hỗn hợp chuẩn làm việc thu đƣợc có nồng độ 100 ng/mL. Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc sẽ đƣợc pha mới vào mỗi ngày phân tích mẫu.
* Xây dựng dãy chuẩn
Dãy chuẩn SB, DSB và DDSB có nồng độ nằm trong khoảng từ 5 ng/mL đến 100 ng/mL. Dãy chuẩn gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ lần lƣợt là 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL và 100 ng/mL.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ đƣợc sử dụng là hệ thống khối phổ 5500QQQ ghép nối với hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC20AD của Shimadzu đƣợc thể hiện trong hình 2.1, đây là thiết bị có độ nhạy cao, phù hợp với đối tƣợng mẫu phân tích là mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nền mẫu phức tạp. Do đó, nhóm nghiên cứu đã chọn để định lƣợng SB, DSB và DDSB.
Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ được lựa chọn sử dụng * Điều kiện LC
Cột sắc ký C18 (100mm x 2,1mm, 3,5µm) và tiền cột tƣơng ứng của hãng Waters, Mỹ đƣợc lựa chọn trong đề tài này. Loại dung môi, tỉ lệ các thành phần dung môi, tốc độ rửa giải của pha động ảnh hƣởng đến hiệu quả tách các chất. Đây là lí do cần phải khảo sát thành phần hệ pha động, tốc độ rửa giải trong quá trình phân tích SB, DSB và DDSB. Dựa trên một số tham khảo [9, 10, 16, 20, 32] và các dung môi, hóa chất của phòng thí nghiệm, 05 hệ pha động đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu bao gồm:
Hệ pha động 1: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM;
Hệ pha động 2: kênh A: MeOH, kênh B: ammoni acetate 2mM;
Hệ pha động 3: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM;
Hệ pha động 4: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM+ acid formic 0,1%;
Hệ pha động 5: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O.
* Điều kiện MS
Sau khi đƣợc phân tách bởi hệ thống LC, chất phân tích sẽ đƣợc hóa hơi tạo thành các ion. Các ion đƣợc chuyển đến lối vào của hệ thống phân tích khối phổ MS loại dung môi chuyển vào bộ phận MS của máy khối phổ thông qua bộ phận ghép nối LC-MS.
Điều kiện phân mảnh, điều kiện của nguồn và khí đƣợc tự động tối ƣu trên hệ thống MS. Bơm trực tiếp dung dịch mỗi chuẩn đơn vào đầu dò khối phổ với chế độ ion dƣơng (ESI+), chế dộ ghi phổ MRM. Lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con đối với mỗi chất phân tích, ion có cƣờng độ cao hơn đƣợc sử dụng để định lƣợng, ion có cƣờng độ thấp hơn sử dụng để khẳng định.
2.6.2. Phương pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ
Mẫu dạng viên nang cứng: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều
Mẫu dạng viên nang mềm: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều
Mẫu dạng trà túi lọc: lấy 20 túi lọc, bỏ túi, xay trộn đều khoảng 20 – 50 g
* Quy trình chiết
Khảo sát dung môi chiết
Để chọn đƣợc dung môi chiết mẫu thích hợp, mẫu đƣợc chiết bằng 04 loại dung môi khác nhau: MeOH, ACN, EtOH, Acetone (nhƣ phần 2.2.2). Mẫu thêm chuẩn đƣợc chiết bằng 4 dung môi, dung môi đƣợc lựa chọn là dung môi cho độ thu hồi mẫu thêm chuẩn cao hơn. Mẫu thêm chuẩn là mẫu có nền là TPBVSK hỗ trợ giảm cân không chứa chất phân tích, sau đó đƣợc thêm các chuẩn SB, DSB và DDSB.
Khảo sát thời gian chiết
Sau khi chọn đƣợc dung môi chiết phù hợp, tiến hành khảo sát thời gian chiết mẫu. Cân mẫu, thêm dung môi, rung, siêu âm và chiết trong 10 phút, 30 phút, 60 phút. So sánh hiệu suất thu hồi của chất phân tích để chọn thời gian chiết thích hợp.
Khảo sát số lần chiết
Chất phân tích tan trong dung môi chiết, để chiết đƣợc tối đa chất phân tích khỏi nền mẫu, thông thƣờng sẽ chiết nhiều lần. Chất phân tích đƣợc tiến hành chiết 1 lần, 2 lần, 3 lần trên cả 3 nền mẫu: viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc. Đánh giá hiệu suất thu hồi để chọn lựa số lần chiết phù hợp.
Khảo sát quy trình làm sạch mẫu
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết, do mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thƣờng có chứa các tạp màu, để loại tạp và tăng tuổi thọ cho thiết bị LC-MS/MS, nhóm
nghiên cứu tiến hành khảo sát 4 quy trình làm sạch mẫu khác nhau. Mẫu sau khi chiết và định mức, sẽ đƣợc tiến hành làm sạch theo các qui trình nhƣ trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Quy trình làm sạch mẫu Quy trình 1 Không có giai đoạn làm sạch Quy trình 2 Làm sạch qua cột SPE SCX Quy trình 3 Làm sạch qua cột SPE HLB (mẫu đƣợc hòa tan trong
dung dịch acid H3PO4)
Quy trình 4
Làm sạch bằng kỹ thuật d-SPE sử dụng các bon hoạt tính (mẫu
sau khi chiết bằng MeOH, thêm 4,0 gam MgSO4, 1,5 gam NaCl
lắc mạnh 1 phút, rung siêu âm 30 phút và định mức) Lọc mẫu qua giấy lọc và màng lọc 0,22 µm - Hoạt hóa cột: 6 mL MeOH, 6 mL H2O. - Nạp mẫu: 4 mL - Rửa tạp bằng 3 mL H2O, 3 mL MeOH. - Rửa giải: 4 mL MeOH : NH4OH (95:5, v/v) - Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O. - Nạp mẫu: 4 mL - Rửa tạp: 3 mL H2O - Rửa giải: 3 mL MeOH - Hút 10 mL dịch chiết vào ống d-SPE có chứa sẵn 25 mg GCB.
- Lắc khoảng 30 giây – 1 phút.
- Ly tâm khoảng 1 phút, hút ra vial (không để lâu trong ống chứa bột làm sạch, tránh ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi).
Mẫu sau khi đƣợc làm sạch ở các điều kiện khác nhau sẽ đƣợc tiến hành phân tích trên thiết bị LC-MS/MS. Đánh giá độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn theo 4 quy trình trên là căn cứ để chọn lựa quy trình làm sạch mẫu tối ƣu.
2.6.3. Phương pháp thẩm định
2.6.3.1. Tính chọn lọc
Tính chọn lọc của phƣơng pháp đƣợc đánh giá bằng cách so sánh phổ của mẫu chuẩn SB, DSB, DDSB trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu trên mẫu chuẩn. Ngoài ra, tính chọn lọc còn đƣợc khẳng định bằng số điểm nhận dạng IP, yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu.
2.6.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ đƣợc xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) [1].
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 3).
LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 10).
2.6.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích.
Khoảng làm việc của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dƣới của chất phân tích, tại đó đƣợc chứng minh là có thể xác định đƣợc bởi phƣơng pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.
Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 5 đến 100 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc và nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Sau khi xác định đƣợc khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc có hệ số tƣơng quan R nằm trong
2.6.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 10, 20 và 50 µg/kg (n = 6), tính toán kết quả theo các công thức sau:
Độ lặp lại đƣợc biểu diễn theo độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) biểu diễn bởi công thức (1).
RSD(%) = Trong đó:
xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ ―i‖ : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm. n : Số lần thử nghiệm.
Độ thu hồi biểu diễn bởi công thức (2) R(%) = C
Cc .100 Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn. Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết).
2.6.4. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu theo phƣơng pháp lấy mẫu ngẫu nhiên
Lƣợng mẫu lấy phù hợp với thông tƣ 14/2011/TT-BYT.
Địa điểm lấy mẫu: Các cửa hàng thuốc tại Hà Nội.
2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu
Tính hàm lƣợng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong mẫu bằng phần mềm của thiết bị LC-MS/MS (Analyst 1.5). Các kết quả thẩm định phƣơng pháp đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
100 . x S 1 1 2 N x x S N i i x (1) (2)
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện LC-MS/MS xác định đồng thời SB, DSB và DDSB trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân DDSB trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân
3.1.1. Điều kiện MS/MS
Tiến hành bơm dung dịch chuẩn SB, DSB, DDSB có nồng độ 5 ng/mL vào hệ thống MS. Sau khi chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử mẹ thành các ion con, khảo sát ion mẹ, ion con trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu trƣớc đây [16, 32, 44]. Hai ion con đƣợc lựa chọn cho mỗi chất, ion con có cƣờng độ cao hơn đƣợc sử dụng để định lƣợng và ion có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận, các kết quả đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích SB, DSB, DDSB
STT Chất phân tích Khối lƣợng phân tử Thời gian lƣu (phút) Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Thế ion hóa (V) Năng lƣợng bắn phá (E) 1 SB 278,9 6,37 279,9 124,8 24 26 6,38 138,4 12 26 2 DSB 265,0 6,33 266,0 124,8 22 28 6,34 138,8 16 28 3 DDSB 251,1 6,27 252,1 125,0 47 11 6,28 139,1 47 11
Qua bảng số liệu 3.1. cho thấy, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của SB, DSB và DDSB, số khối của các ion mẹ tƣơng ứng với từng chất phân tích, chúng đều có dạng là [M+H]+, mỗi chất thu đƣợc 2 ion con. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả với một số nghiên cứu trƣớc đây [16, 32, 44]. Để tối ƣu hóa điều kiện MS cho từng chất, nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật FIA, hỗn hợp SB, DSB và DDSB có nồng độ 1µg/mL đƣợc bơm trực tiếp vào
Kênh A: ACN
Kênh B: Ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O
Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lƣợng và định tính của từng chất. Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion, thu đƣợc kết quả các thông số tối ƣu liệt kê trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS để phân tích SB, DSB và DDSB
Thông số Giá trị tối ƣu
IS (V) 5500 TEM (oC) 400 GS1 (psi) 20 GS2 (psi) 20 EP (V) 10 CUR (psi) 25 CAD (psi) 9
3.1.2. Khảo sát điều kiện LC
a. Pha tĩnh
Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký. Cột pha đảo C8, C18 đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định SB và chất chuyển hóa của SB [16, 22, 32]. Dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn cột tách là cột pha đảo C18. Trong nghiên cứu này, cột C18 (100mm x 2,1mm, 3,5µm) và tiền cột tƣơng ứng đƣợc sử dụng để tách SB, DSB và DDSB.
b. Pha động
Pha động ảnh hƣởng đến khả năng tách các chất trong hỗn hợp. Tỉ lệ thành phần các dung môi trong pha động sẽ tác động đến khả năng lƣu giữ chất phân tích trên cột khác nhau, tốc độ dòng pha động cũng ảnh hƣởng tới độ phân giải của hỗn
hợp chất phân tích. 5 hệ dung môi đƣợc lựa chọn nhƣ phần 2.6.1. Chƣơng trình gradient dung môi đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chương trình gradient dung môi phân tích SB, DSB, DDSB
Gradient Thời gian (phút) Thành phần pha động % ACN % MeOH Ammoni acetate 2mM Ammoni formate 2mM Ammoni formate 2mM+ acid formic 0,1% Ammoni acetate 2mM+ acid formic 0,1% Gradient 1 0,00 90 - 10 - - - 2,00 90 - 10 - - - 5,00 10 - 90 - - - 8,00 90 - 10 - - - Gradient 2 0,00 - 90 10 - - - 2,00 - 90 10 - - - 5,00 - 10 90 - - - 8,00 - 90 10 - - - Gradient 3 0,00 90 - - 10 - - 2,00 90 - - 10 - -