Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành thẩm định phƣơng pháp với các thông số cơ bản sau:
Độ đặc hiệu LOD, LOQ Khoảng tuyến tính Độ lặp lại Độ tái lặp Độ thu hồi 3.3.1. Độ đặc hiệu 3.3.1.1. Tính số điểm IP
Thực hiện bắn phá các ion mẹ và ghi nhận lại các ion con. Theo cách tính điểm IP, mỗi ion mẹ đƣợc tính là 1 điểm, mỗi ion con là 1,5 điểm. Kết quả thu đƣợc trong bảng 3.1 cho thấy SB, DSB và DDSB đều thu nhận đƣợc 1 ion mẹ và 2 ion con và có số điểm IP = 4 [1], điều này khẳng định sự chắc chắn có mặt của SB, DSB, DDSB trên sắc ký đồ và phƣơng pháp LC-MS/MS đƣợc nhóm nghiên cứu lựa chọn có tính đặc hiệu.
3.3.1.2. Tỷ lệ ion
Để khẳng định sự có mặt của các chất phân tích, tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn, so sánh tỷ lệ giữa ion xác nhận và ion định lƣợng, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Tỷ lệ ion và sai số cho phép
SB DSB DDSB
Mẫu chuẩn 5,0 5,0 5,0
Mẫu thêm chuẩn 4,5 4,1 5,0
% sai lệch cho phép ± 50 % ± 50 % ± 50 %
Khoảng cho phép 4,0 – 6,0 4,0 – 6,0 4,0 – 6,0
Kết quả tỷ lệ ion và sai số cho phép thu đƣợc ở bảng 3.9 đạt yêu cầu, điều này khẳng định sự có mặt của SB, DSB và DDSB và lựa chọn phƣơng pháp LC- MS/MS là phù hợp.
3.3.1.3. Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 5 ng/mL trên các nền mẫu khác nhau. Sắc đồ của các mẫu đƣợc trình bày ở hình 3.10, 3.11, 3.12.
Hình 3.10. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn SB
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DDSB
Trên sắc đồ mẫu trắng hình 3.10, 3.11 và 3.12 không có tín hiệu của chất phân tích, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn có pic của SB, DSB và DDSB ở thời gian trùng khớp với thời gian lƣu của chuẩn tƣơng ứng (chênh lệch thời gian lƣu không quá 2%). Nhƣ vậy, phƣơng pháp là đặc hiệu để phân tích SB, DSB và DDSB.
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích. Phân tích lặp lại 6 lần. Tiến hành xác định tỷ lệ S/N tự động theo phần mềm của máy. Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó có S/N = 3. Giới hạn định lƣợng là giới hạn mà tại đó S/N = 10 hay LOQ = 3,3 LOD. Sắc ký đồ và S/N của SB, DSB, DDSB trên nền mẫu nang mềm đƣợc trình bày ở hình 3.13, 3.14 và 3.15.
Mẫu trắng
Hình 3.13. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn SB (0,05 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm
Hình 3.14. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DSB (0,1 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm
Hình 3.15. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DDSB (0,1 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm
DDSB SB S/N=3,2 DSB S/N =3,5 S/N=3,9
Qua kết quả thu đƣợc trên sắc đồ ở hình 3.13, 3.14 và 3.15 cho thấy, tại mức hàm lƣợng 0,05 µg/kg, tỷ lệ S/N ≥ 3 đối với SB, do đó LOQ của SB trên nền viên nang mềm là 0,15 µg/kg; tại mức hàm lƣợng 0,1 µg/kg, tỷ lệ S/N ≥ 3 đối với DSB và DDSB, vì vậy LOQ của DSB và DDSB là 0,3 µg/kg. Khi thêm chuẩn SB, DSB và DDSB trên nền mẫu viên nang cứng và trà túi lọc, nhóm nghiên cứu cũng thu đƣợc kết quả LOD và LOQ giống mẫu viên nang mềm. Với giới hạn định lƣợng thu đƣợc, phƣơng pháp có đủ hiệu năng để có thể phân tích các mẫu TPBVSK trên thị trƣờng, đáp ứng đƣợc yêu cầu theo quy định tại một số nƣớc Châu âu (EU), Nhật Bản, Hoa Kỳ.
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn 5 điểm có các nồng độ tƣơng ứng 5; 10; 20; 50; 100 ng/mL và phân tích trên LC-MS/MS. Xây dựng đƣờng phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ tƣơng ứng. Đƣờng chuẩn đƣợc lập theo phần mềm của thiết bị và đƣợc trình bày ở hình 3.16 đến 3.18.
Hình 3.16. Đường chuẩn SB
y=5,08e+004x+5,35e+003 R2=0,9982
Hình 3.17. Đường chuẩn DSB
Hình 3.18. Đường chuẩn DDSB
Khoảng đƣờng chuẩn và độ chệch của các điểm chuẩn của từng chất phân tích đƣợc trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Khoảng đường chuẩn và độ chệch
C (ng/g) C tính lại (ng/g) Bias (%) C tính lại (ng/g) Bias (%) C tính lại (ng/g) Bias (%) 5 5,61 12,10 5,54 10,71 4,95 -1,00 10 10,78 7,80 10,28 2,80 10,98 9,81 20 21,20 6,00 21,30 6,50 21,34 6,70 y=6,41e+004x+7,18e+004 R2=0,9998 y=4,93e+004x+6,72e+004 R2=0,9985
50 49,70 -0,60 51,91 3,81 51,26 2,52
100 104,52 4,52 98,60 -1,40 98,60 -1,40
SB DSB DDSB
Kết quả trong bảng 3.10 cho thấy, trong khoảng nồng độ từ 5 ng/mL đến 100 ng/mL, nồng độ và diện tích pic của 03 chuẩn DB, DSB và DDSB có mối quan hệ tuyến tính, hệ số tƣơng quan hồi quy (R2 > 0,99), độ chính xác của tất cả các điểm đáp ứng yêu cầu của AOAC, giá trị độ chệch từng điểm chuẩn nằm trong khoảng ±15%. Vì vậy, khoảng nồng độ từ 5 ng/mL đến 100 ng/mL đƣợc nhóm nghiên cứu chọn là khoảng định lƣợng.
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 10; 20; 50 µg/kg, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Thêm chuẩn vào 3 nền mẫu viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc. Các kết quả độ lặp lại, độ thu hồi đƣợc trình bảy ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ lặp lại (RSD%) và độ thu hồi (R%) của SB, DSB và DDSB trên các nền mẫu Nền mẫu Chất phân tích 10 µg/kg, n = 6 20 µg/kg, n = 6 50 µg/kg, n = 6 R (%) RSD (%) R (%) RSD (%) R (%) RSD (%) Viên nang cứng SB 90,6 8,90 99,0 6,42 100,1 6,32 DSB 92,7 7,30 107,3 5,25 101,6 4,98 DDSB 100,1 4,52 84,9 5,01 94,7 3,75 Viên nang mềm SB 100,4 6,32 100,5 5,85 105,7 5,01 DSB 100,5 10,5 100,5 7,85 107,0 7,01 DDSB 102,6 8,34 104,1 7,56 105,0 4,85 Trà túi lọc SB 100,5 5,34 109,5 8,72 100,5 6,09 DSB 109,0 4,78 87,7 7,34 93,6 4,01 DDSB 101,8 6,03 108,3 5,85 102,3 4,79
Các kết quả trên cho thấy, giá trị độ thu hồi trung bình của SB, DSB và DDSB cả 3 nền mẫu viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc lần lƣợt nằm trong khoảng 90,6 – 109,5 %, 92,7 – 109,0% và 84,9 – 108,3%; độ lệch chuẩn tƣơng đối tƣơng ứng từ 5,01 – 8,90 %, 4,01 – 10,5%, 3,75 – 8,34%. Các kết quả này cho thấy phƣơng pháp có độ chính xác đáp ứng yêu cầu của AOAC (độ thu hồi 80- 115% và độ lệch chuẩn tƣơng đối ≤ 15% tại nồng độ 10 µg/kg).
3.4. Phân tích mẫu thực tế
Phƣơng pháp đã xây dựng đƣợc áp dụng để xác định hàm lƣợng SB, DSB và DDSB trong 30 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân trên thị trƣờng. Kết quả cho thấy phát hiện 02/7 mẫu trà túi lọc có chứa sibutramine, trong đó có 01 mẫu chứa đồng thời sibutramine và desmethyl sibutramine, 06/11 mẫu viên nang cứng có chứa sibutramine, 03 mẫu đồng thời chứa sibutramine và desmethyl sibutramine. Sắc đồ các mẫu có chứa sibutramine đƣợc thể hiện ở hình 3.19 và 3.20.
Hình 3.20. Sắc đồ các mẫu chứa desmethyl sibutramine
Kết quả định lƣợng SB, DSB và DDSB trong các mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân đã đƣợc tiến hành lấy và phân tích đƣợc trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả định lượng SB, DSB và DDSB một số mẫu TPBVSK STT Quy cách Tên sản phẩm SB (mg/g) DSB (mg/g) DDSB (mg/g) 1 Trà Slimutea KPH KPH KPH 2 Trà Đại Gia KPH KPH KPH 3 FA2 KPH KPH KPH 4 Hera + 5,248 1,642 KPH 5 Tana porn KPH KPH KPH 6 Fasmine Tea 0,817 KPH KPH
7 Trà giảm cân Kingphar slim KPH KPH KPH
8 Viên nang mềm Giảm cân PV KPH KPH KPH 9 Change Body KPH KPH KPH 10 Viên nang cứng
Viên uống giảm cân
Sevendays 11,584 0,265 KPH
11 Slim Phục Linh 16,508 0,420 KPH
12 Minhon 10 KPH KPH KPH
13 Giảm béo Phục Linh Sao
Việt KPH KPH KPH
14 Áo Đình KPH KPH KPH
15 New Lishow 45 viên KPH KPH KPH
16 New Lishow 24 viên KPH KPH KPH
17 Slimatic collagen KPH KPH KPH
18 EVA 31,471 1,127 KPH
19 Super model KPH KPH KPH
Ghi chú: KPH - Không phát hiện
Qua bảng kết quả phân tích mẫu thực tế cho thấy có 06 mẫu viên nang cứng, 02 mẫu trà túi lọc có chứa SB, hàm lƣợng nằm trong khoảng 0,817 – 31,473 mg/g và 03 mẫu viên nang cứng, 01 mẫu trà túi lọc chứa DSB với hàm lƣợng nằm trong khoảng 0,265 - 1,642 mg/g; không phát hiện mẫu viên nang mềm chứa SB, DSB và DDSB (do hàm lƣợng nằm dƣới giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đã đƣợc thẩm định). Nhƣ vậy, số lƣợng mẫu chứa SB chiếm 23,3% tổng số mẫu đƣợc phân tích, số lƣợng mẫu chứa DSB chiếm 13,3% tổng số mẫu kiểm nghiệm. Mẫu chứa SB tập trung vào dạng viên nang cứng. Qua kết quả nghiên cứu cũng cho thấy các nhà sản xuất cũng đã trộn thêm dẫn xuất của sibutramine vào trong sản phẩm của mình, tuy chƣa phát hiện đƣợc DDSB trong các mẫu, nhƣng phƣơng pháp xây dựng có ý nghĩa đi trƣớc trong nghiên cứu, đón đầu phát hiện các dẫn xuất của SB để kịp thời khuyến cáo cho ngƣời sử dụng.
21 Venus KPH KPH KPH 22 Vin Slim KPH KPH KPH 23 Miszz eva KPH KPH KPH 24 Change Body KPH KPH KPH 25 Betty Slim KPH KPH KPH 26 Forkilon mega KPH KPH KPH 27 Slim night 7,392 KPH KPH 28 Betty slim KPH KPH KPH 29 Đệ nhất dáng KPH KPH KPH 30 Green data 15,088 KPH KPH
KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu, luận văn thu đƣợc các kết quả sau:
1. Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện LC-MS/MS để phân tích đồng thời SB, DSB và DDSB: Cột tách sắc ký C18 (100 mm x 2,1 mm, 3,5 µm); pha động là gradient kênh A: ACN, kênh B: Ammoni acetate 2 mM trong acid formic 0,1%, tốc độ dòng 0,4 mL/phút.
2. Đã khảo sát đƣợc qui trình chiết và loại tạp màu cho mẫu: chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 20mL MeOH, rung siêu âm 15 phút; loại tạp bằng 25 mg than hoạt tính cho 15ml dịch chiết.
3. Đã thẩm định phƣơng pháp xác định đồng thời Sibutramine, Desmethylsibutramine và Didesmethylsibutramine với các kết quả:
Phƣơng pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu.
Khoảng đƣờng chuẩn của cả 03 chất phân tích nằm trong khoảng nồng độ từ 5 ng/mL - 100 ng/mL, với hệ số tƣơng quan cao
Giới hạn phát hiện là 0,05 µg/kg, giới hạn định lƣợng là 0,15 µg/kg đối với SB; giới hạn phát hiện là 0,1 µg/kg, giới hạn định lƣợng là 0,3 µg/kg đối với DSB và DDSB trên cả 03 nền mẫu viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc.
Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp tốt với RSD% < 15% và độ thu hồi đạt đƣợc từ 84,9 đến 109,5% ở mức thêm chuẩn 10 µg/kg, đáp ứng yêu cầu của AOAC.
4. Đã áp dụng quy trình đƣợc thẩm định để xác định hàm lƣợng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trộn trái phép trong 30 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân trên địa bàn Hà Nội. Kết quả cho thấy có 06/ 21 mẫu viên nang cứng, 02/7 mẫu trà túi lọc có chứa sibutramine, hàm lƣợng nằm trong khoảng 0,817 – 31,473 mg/g, 03/21 mẫu viên nang cứng, 01/7 mẫu trà túi lọc chứa desmethyl sibutramine với hàm lƣợng nằm trong khoảng 0,265 - 1,642 mg/g; không phát hiện mẫu viên nang mềm chứa sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc Gia (2010), "Thẩm định phương pháp
trong phân tích hoá học và vi sinh vật", Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà
Nội.
2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), ―Các phương pháp phân tích công cụ”, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
3. Juan M Aceves-Hernández, Inés Nicolás Vázquez, Jaime Hinojosa-Torres, Guillermo Penieres Carrillo, Gabriel Arroyo Razo, và René Miranda Ruvalcaba (2013), "Sibutramine characterization and solubility, a theoretical study", Journal of Molecular Structure, 1038, pp. 163-169.
4. European Medicines Agency (2010), "European Medicines Agency
recommends suspension of marketing authorisation for sibutramine", 14(2),
pp. 11-13.
5. Shigeki Akamatsu và Takao Mitsuhashi (2013), "Simultaneous determination of pharmaceutical components in dietary supplements for weight loss by capillary electrophoresis tandem mass spectrometry", Drug testing and analysis, 6, pp. 15-23.
6. Etil Ariburnu, Mehmet Fazli Uludag, Huseyin Yalcinkaya, và Erdem Yesilada (2012), "Comparative determination of sibutramine as an adulterant in natural slimming products by HPLC and HPTLC densitometry", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 64, pp. 77-81.
7. J. Bhatt, B. Shah, S. Kambli, G. Subbaiah, S. Singh, và S. Ameta (2007), "Rapid and sensitive method for the determination of sibutramine active metabolites in human plasma by reversed-phase liquid chromatography- tandem mass spectroscopy", J Chromatogr Sci, 45 (2), pp. 91-96.
8. Maciej J Bogusz, Huda Hassan, Eid Al-Enazi, Zuhour Ibrahim, và Mohammed Al-Tufail (2006), "Application of LC–ESI–MS–MS for detection of synthetic adulterants in herbal remedies", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 41(2), pp. 554-564.
9. J. Chen, W. Lu, Q. Zhang, và X. Jiang (2003), "Determination of the active metabolite of sibutramine by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 785(2), pp. 197-203.
10. Y Chen, L Zhao, F Lu, Y Yu, Y Chai, và Y Wu (2009), "Determination of synthetic drugs used to adulterate botanical dietary supplements using QTRAP LC-MS/MS", Food Additives and Contaminants, 26(5), pp. 595-
603.
11. Marlus Chorilli, Rudy Bonfilio, Renata Chicarelli, và Herida Salgado (2011), "Development and validation of an analytical method by RP-HPLC for quantification of sibutramine hydrochloride in pharmaceutical capsules",
Anal. Methods, 3, pp. 985-990.
12. Li Ding, Xinyu Hao, Xin Huang, và Shengqiang Zhang (2003), "Simultaneous determination of sibutramine and its N-desmethyl metabolites in human plasma by liquid chromatography–electrospray ionization–mass spectrometry: Method and clinical applications", Analytica chimica acta,
492(1-2), pp. 241-248.
13. FDA (2010),"The FDA August 2010 drugs safety update", Journal of Pharmaceutical Analysis, pp. 152-155.
14. Stanley D Glick, Renee E Haskew, Isabelle M Maisonneuve, Jeffrey N Carlson, và Thomas P Jerussi (2000), "Enantioselective behavioral effects of sibutramine metabolites", European journal of pharmacology, 397(1), pp.
93-102.
15. Hayun Hayun, Baitha P Maggadani, và Nurul Amalina (2016), "Determination of sibutramine adulterated in herbal slimming products using TLC densitometric method", Indonesian Journal of Pharmacy, 27(1), p. 15.
16. Ziqiang Huang, Song Xiao, Dan Luo, Bo Chen, và Shouzhuo Yao (2008), "Simultaneous determination of sibutramine and N-di-desmethylsibutramine in dietary supplements for weight control by HPLC—ESI-MS", Journal of chromatographic science, 46(8), pp. 707-711.
17. Julia Jung, Maren Hermanns-Clausen, và Wolfgang Weinmann (2006), "Anorectic sibutramine detected in a Chinese herbal drug for weight loss",
Forensic science international, 161(2-3), pp. 221-222.
18. Tarita Kamardi, Irda Fidrianny, và A. Musadad (2016), "Development of analytical method for identification of sibutramine hydrochloride in traditional medicine using solid phase extraction: High-performance liquid chromatography", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research,
9, pp. 201-209.
19. S Kanan, IA Abu-Yousef, C Gunasekar, N Abdo, và S Narasimhan (2009), "Detection and quantification of synthetic drugs in herbal slimming formula", Eur J Sci Res, 34, pp. 348-357.
20. W. Kang, K. Bae, và K. Noh (2010), "Enantioselective determination of sibutramine and its active metabolites in human plasma", J Pharm Biomed Anal, 51(1), pp. 264-267.
21. Marjan Khazan, Mehdi Hedayati, Farzad Kobarfard, Sahar Askari, Fereidoun Azizi (2014), "Identification and determination of synthetic pharmaceuticals as adulterants in eight common herbal weight loss supplements", Iranian Red Crescent Medical Journal, 16(3), pp. 17-21. 22. S. H. Kim, J. Lee, T. Yoon, J. Choi, D. Choi, D. Kim, và S. W. Kwon
(2009), "Simultaneous determination of anti-diabetes/anti-obesity drugs by