Chúng tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat (pH=3) theo các tỉ lệ 30:70, tỉ lệ 20:80 và tỉ lệ 10:90. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm). Kết quả thu được như sau.
Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động 10:90
B1 B6 B12 B1 B6 B12
Hình 3.8. Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động 30:70
Hình 3.9. Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động 20:80 Nhận xét: Kết quả ở hình 3.7; 3.8 và 3.9 cho thấy, với tỉ lệ pha động là 30:70 thì các chất được tách ra tương đối tốt nhưng thường bị doãng chân pic. Với tỉ lệ pha động 10:90 thì B6 và B12 gần như không tách ra khỏi nhau. Chính vì vậy, tỉ lệ pha động 20:80 là tối ưu nhất để tách 3 vitamin ra khỏi nhau.
Kết luận chung: Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phép xác định vitamin B1, B6, B12 bằng phương pháp HPLC là:
Cột tách: cột C18.
Detector PDA bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm) trong cùng một phép đo.
Tốc độ dòng chảy: 1,0 mL/phút.
Pha động: kênh A: dung dịch đệm photphat (pH=3) + kênh B: dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 về thể tích.
Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm photphat (pH=3) và dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 về thể tích. B1 B6 B12 B1 B6 B12
Với các điều kiện như trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích đồng thời cả 3 vitamin B1, B6, B12 bằng cách tiến hành đo với mẫu giả và kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 3.2. Đánh giá phương pháp định lượng
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ Vitamin B1 và B16 và B12 được khảo sát khoảng tuyến tính từ 0,4 (ppm) - 2,8 (ppm). Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 3 vitamin được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1, B6 và B12
Vitamin B1 Vitamin B6 Vitamin B12
Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) 0,4 69936 0,4 58998 0,4 9312 0,8 95585 0,8 80251 0,8 31498 1,2 117234 1,2 105503 1,2 56114 1,4 129059 1,4 117129 1,4 67932 1,6 140884 1,6 129755 1,6 76829 2,2 176358 2,2 162364 2,2 116153 2,8 211831 2,8 198512 2,8 149576 y = 58779x+47083 y = 58276x + 35206 y = 58860x - 14962 R2 = 0,9998 R2 = 0,9996 R2 = 0,9993
LOD = 0,054 LOD = 0,095 LOD = 0,076
B1
B6
Nhận xét:
Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
Từ kết quả ở bảng 3.2, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị 3.11; 3.12; 3.13.
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B1
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B6
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B12
3.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12 theo phương pháp thêm chuẩn phương pháp thêm chuẩn
3.2.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6 và B12 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
Cân chính xác 5,0000 gam sữa bột Dielac Alpha Gold ứng với 0,0315 mg vitamin B1, 0,0375 mg vitamin B6 và 0,075 μg vitamin B12 cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL vitamin B1, B6 hoặc B12 chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3.3; 3.4; 3.5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B1 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00 Thể tích dung môi pha mẫu
(mL)
25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B1 sau khi
pha (ppm)
1,26 2,06 2,86 3,26 4,06 4,86
Bảng 3.4. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B6 thêm vào
(mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B6 thêm
vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00
Thể tích dung môi pha mẫu
(mL) 25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0
Nồng độ vitamin B6 sau khi
Bảng 3.5. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 12 13 14 15 16 Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B12 thêm vào
(mL)
- 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm)
- 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00
Thể tích dung môi pha mẫu (mL)
25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B12 sau khi
pha (ppm)
0,003 0,803 1,163 2,003 2,803 3,603
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 1,260 0 1,260 120856 y=58797x+46029 R2=0,9988 2 1,260 0,8 2,060 165158 3 1,260 1,6 2,860 215456 4 1,260 2,0 3,260 240105 5 1,260 2,8 4,060 280404 6 1,260 3,6 4,860 333702
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính
Từ kết quả ở bảng 3.6, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.14.
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac
Alpha Gold
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 1,500 0 1,500 124695 y=60643x+31392 R2=0,9988 2 1,500 0,8 2,300 171201 3 1,500 1,6 3,100 216704 4 1,500 2,0 3,500 242659 5 1,500 2,8 4,300 289164 6 1,500 3,6 5,100 334669
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9988).
Từ kết quả ở bảng 3.7, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.15.
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac
Alpha Gold
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 0,003 0 0,003 … y=58875x-15260 R2=0,9998 2 0,003 0,8 0,803 32873 3 0,003 1,6 1,603 78822 4 0,003 2,0 2,003 101298 5 0,003 2,8 2,803 150247 6 0,003 3,6 3,603 197196
Nhận xét: Với giá trị nồng độ là 0,003 (ppm) không thu được giá trị diện tích pic. Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9998).
Từ kết quả ở bảng 3.8, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.16:
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột
Dielac Alpha Gold
3.2.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6 và B12 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
Cân chính xác 5,0000 gam sữa bột Dielac Grow Plus ứng với 0,0550 mg vitamin B1; 0,0550 mg vitamin B6 và 0,1100 μg vitamin B12 cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL vitamin B1, B6 hoặc B12 chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3.9; 3.10; 3.11 thêm vào các ống tương ứng, thêm dung môi pha mẫu cho tổng thể tích là 25 mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm
Bảng 3.9. Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B1 thêm vào
(mL)
- 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm)
- 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00
Thể tích dung môi pha mẫu (mL)
25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B1 sau khi pha
(ppm)
2,20 3,00 3,80 4,20 5,00 5,80
Bảng 3.10. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B6 thêm vào
(mL)
- 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm)
- 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00 Thể tích dung môi pha mẫu
(mL)
25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B6 sau khi pha
(ppm)
Bảng 3.11. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
Mẫu 1 12 13 14 15 16 Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B12 thêm vào
(mL)
- 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm)
- 4,00 8,00 10,00 14,00 18,00
Thể tích dung môi pha mẫu (mL)
25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B12 sau khi
pha (ppm)
0,004 0,804 1,604 2,004 2,804 3,604
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 2,200 0 2,200 176243 y=59006x+47242 R2=0,9998 2 2,200 0,8 3,000 225281 3 2,200 1,6 3,800 271418 4 2,200 2,0 4,200 295873 5 2,200 2,8 5,000 340874 6 2,200 3,6 5,800 389915
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9998).
Từ kết quả ở bảng 3.12, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.17.
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac
Grow Plus
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 2,200 0 2,200 167604 y=59934x+38034 R2=0,9991 2 2,200 0,8 3,000 222182 3 2,200 1,6 3,800 216704 4 2,200 2,0 4,200 242659 5 2,200 2,8 5,000 289164 6 2,200 3,6 5,800 334669
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính
Từ kết quả ở bảng 3.13, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.18.
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac
Grow Plus
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 0,004 0 0,004 … y=58601x-14191 R2=0,9998 2 0,004 0,8 0,804 32094 3 0,004 1,6 1,604 81481 4 0,004 2,0 2,004 102744 5 0,004 2,8 2,804 149844 6 0,004 3,6 3,604 196944
Nhận xét: Với giá trị nồng độ là 0,004 (ppm) không thu được giá trị diện tích pic. Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9998).
Từ kết quả ở bảng 3.14, chúng tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.19.
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột
Dielac Grow Plus
3.2.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6 và B12 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold
Hút chính xác 15 mL sữa tươi Dielac Alpha Gold ứng với 0,0167 mg vitamin B1; 0,030 mg vitamin B6 và 0,0558 μg vitamin B12 cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL vitamin B1, B6 hoặc B12 chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3.15; 3.16; 3.17 thêm vào các ống tương ứng, thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích là 25 mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 μm.
Bảng 3.15. Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 2 3 4 5 6 Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B1 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) - 4,000 8,000 10,000 14,000 18,000 Thể tích dung môi pha mẫu
(mL) 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B1 sau khi pha (ppm)
0,668 1,468 2,268 2,668 2,468 4,268
Bảng 3.16. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 7 8 9 10 11 Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B6 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm) - 4,000 8,000 10,000 14,000 18,000 Thể tích dung môi pha
mẫu (mL)
10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B6 sau khi pha (ppm)
Bảng 3.17. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold
Mẫu 1 12 13 14 15 16 Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B12 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm) - 4,000 8,000 10,000 14,000 18,000
Thể tích dung môi pha mẫu (mL)
10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Nồng độ vitamin B12 sau khi pha (ppm)
0,002 0,802 1,602 2,002 2,802 3,602
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic Phương trình hồi quy 1 0,668 0 0,668 85312 y=58749x+46487 R2=0,9998 2 0,668 0,8 1,468 134356 3 0,668 1,6 2,268 179387 4 0,668 2,0 2,668 201906 5 0,668 2,8 3,468 249944 6 0,668 3,6 4,268 297981