2.1.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chọn detector
Các vitamin B1, B6 và B12 hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Mặt khác detector PDA cho pháp quan trắc các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 400 nm trong cùng một phép đo. Đây là điểm ưu việt của detector PDA. Căn cứ vào những điều trên, chúng tôi chọn detector phù hợp cho phép phân tích là detector PDA.
Chọn pha tĩnh
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống HPLC. Cột pha tĩnh thông thường được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 3-10 μm. Chất nhồi cột có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phân tích mẫu. Pha tĩnh thông dụng nhất là silicagan có gắn gốc ankyl mạch
dài, không phân cực, thông dụng nhất là -C18H37. Khoảng 61% các máy HPLC sử dụng loại cột chứa pha tĩnh này. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm, và đường kính cột 6,1 mm để tìm các điểu kiện khác tối ưu hóa việc tách để xác định vitamin B1, B6 và B12
Lựa chọn dung môi.
Các vitamin B1, B6 và B12 đều là những chất hoà tan tốt trong môi trường nước và axit axetic tuy nhiên khó tan trong etanol 96 % và metanol, không tan trong ete, benzen hay clorofom. Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng. Vitamin B6 bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính oxy hóa. Vitamin B12 bền trong bóng tối ở nhiệt độ thường, khá bền với nhiệt. Vitamin B12 dễ bị phân hủy bởi ánh sáng. Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ bị mất hoạt tính và không bền trong môi trường kiềm (pH > 7).
Căn cứ vào tính chất của các vitamin B1, B6 và B12 và các tài liệu tham khảo. Chúng tôi chọn dung dịch đệm photphat (pH=3) làm dung môi cho quá trình nghiên cứu.
Chọn pha động
Trong quá trình sắc ký, pha động được chọn như thế nào là tùy thuộc vào tính chất của mẫu phân tích hoặc nồng độ. Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung môi được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Khi chọn pha động cần chú ý đến một số yêu cầu sau:
- Trơ và không tác dụng hóa học với pha tĩnh. - Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký. - Hòa tan tốt hỗn hợp các chất phân tích. - Phù hợp với loại detector đã chọn.
Pha động là một yếu tố rất linh động, ta có thể dễ dàng thay đổi để thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần các loại dung môi
hữu cơ. Pha động có thể là hệ dung môi không phân cực hoặc hệ dung môi phân cực. người ta thường dùng nhất là hệ CH3OH - H2O hoặc hệ axetonitril - dung dịch đệm photphat. Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực đến không phân cực, vì vậy phạm vi sử dụng phong phú hơn. Trong các nghiên cứu gần đây, phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng thành phần pha động theo gồm kênh A là đệm photphat và kênh B là axetonitril được sử dụng rất hiệu quả trong việc phân tích các vitamin nhóm B trong sữa bột và các mẫu thực phẩm. Do đó, chúng tôi lựa chọn dung môi pha động gồm kênh A là đệm photphat và kênh B là axetonitril để xác định vitamin B1, B6 và B12 trong mẫu sữa.
Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của các vitamin B1, B6 và B12
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), dung dịch chuẩn B6 có nồng độ 2 (ppm) và dung dịch chuẩn B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Do các vitamin nhóm B hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Chúng tôi chọn detector PDA khảo sát các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 400 nm. Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 80:20 về thể tích, tốc độ dòng là 1 mL/phút để tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các vitamin riêng rẽ B1, B6 và B12 từ bước sóng 200 nm đến 400 nm để tìm bước sóng tối ưu cho việc phân tích 3 vitamin.
Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa hỗn hợp vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), vitamin B6 có nồng độ 2 (ppm) và vitamin B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Dựa trên tài liệu tham khảo, khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất trên cột tăng, dẫn đến các vitamin có thể bị tách ra muộn gây doãn chân pic, ngược lại khi giảm tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột sắc ký giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao tăng tuy nhiên không tách được hoàn toàn các vitamin. Dựa trên những điều tham
khảo ở trên, chúng tôi khảo sát hệ dung đôi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat theo các tỉ lệ 30:70; 20:80 và 10:90 về thể tích. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm). Tiến hành khảo sát để tìm ra tỉ lệ tối ưu giữa ACN và dung dịch đệm photphat.
Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa hỗn hợp vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), vitamin B6 có nồng độ 2 (ppm) và vitamin B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động ở các tốc độ là 0,8 mL/phút; 1 mL/phút và 1,2 mL/phút. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 80:20 về thể tích, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm). Tiến hành khảo sát để tìm ra tốc độ dòng chảy tối ưu cho phép phân tích.
Bảng 2.1.Các điều kiện tiến hành sắc ký Điều kiện sắc ký Cụ thể
Máy HPLC Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - Acquity Arc Detector PDA
Cột tách Cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm, và đường kính cột 6,1 mm
Dung môi Dung dịch đệm photphat (pH=3)
Pha động Kênh A: dung dịch đệm photphat (pH=3) Kênh B: dung dịch axetonitril.
Bước sóng hấp thụ quang
Khảo sát các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 400 nm.
Tỉ lệ pha động Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat theo các tỉ lệ 30:70; 20:80 và 10:90. Tốc độ dòng Khảo sát pha động ở các tốc độ là 0,8 mL/phút; 1,0