2. Mục tiêu của đề tài
3.2. Kết quả xác định cấu trúc
3.2.1. Chất 1
Kết quả dữ liệu phổ của chất 1 được tổng hợp ở Bảng 3.2 và các hình dưới đây. Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 1 Ví trí Số liệu đo 13 C NMR (ppm)
Số liệu tham khảo 13C - NMR (ppm) của β-Sitosterol [42, 19] 1 H NMR (ppm), J (Hz) 1 37.10 37.51 1.55-1.75 (m) 2 35.99 31.90 1.18-1.68 (m) 3 71.64 72.01 3.48 (m) 4 42.16 42.50 1.47-1.57 (m) 5 140.59 140.91 6 121.55 121.9 5.27 (br d, 3.7) 7 31.75 32.10 1.45-1.65 (m) 8 31.63 32.11 1.77 (m) 9 49.97 50.32 1.76 (m) 10 36.35 36.74 11 20.94 21.35 1.56 (m); 1.67 (m) 12 39.79 39.96 1.56 (m); 1.64 (m) 13 42.17 42.67 14 56.60 56.93 2.04 (m) 15 24.14 26.34 16 28.11 28.56 17 55.9 56.37 18 11.88 13.38 0.76 (s) 19 19.24 19.25 0.94 (s) 20 33.77 34.24 21 25.83 26.33 0.73 (d, 6.7) 22 45.68 45.85 1.16 -1.19 (m) 23 22.91 23.32 1.76-1.84 (m) 24 11.89 12.28 1.87 (m) 25 29.0 29.46 1.86 (m); 1.89 (m) 26 19.66 20.15 0.8 (t, 6.6) 27 18.88 19.66 1.98 (m) 28 18.62 19.07 0.87 (d, 8.4) 29 11.70 12.08 0.62 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của 1 thấy xuất hiện tín hiệu của nguyên tử H-3 liên kết với nhóm β-OH (δH 3.48, m). Trên phổ cộng hưởng proton của 1 cũng xuất hiện của H trong liên kết bội tại H-6 tại δH 5.29 (br d, 3.7). Tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm methyl bậc ba
cộng hưởng tại δH 0.77 (s), 0.96 (s); 3 nhóm methyl bậc hai cộng hưởng tại δH 0.62 (d, J = 6.7 Hz), 0.73 (d, J = 6.7 Hz), δH 0.87 (3H, d, J = 8.4 Hz) và 1
nhóm thế methyl bậc một tại δH 0.8 (t, J = 6.6 Hz). Các tín cộng hưởng của các nguyên tử hidro khác của hợp chất 1 được thể hiện trong bảng 3.2.
Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1
Phổ 13C-NMR của chất 1 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín hiệu của hai cặp olefin được xác nhận tại C-5 (δC 140.59)/C-6 (δC 121.55)
ppm. Nguyên tử cacbon ở vị trí số 3 cộng hưởng tại δC 71.65 ppm. Các nhóm methyl bậc 3 cộng hưởng tại 11.88 (C-18) và 19.24 ppm (C-19). Qua phổ HSQC, HMBC sự quy kết các tín hiệu của các nguyên tử hidro và cacbon trong hợp chất 1 thể hiện chi tiết trong Bảng 3.2.
Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1
Hình 3.5. Phổ khối lƣợng của chất 1
Trên phổ khối lượng của chất 1 nhận thầy có píc m/z của [M+H]+ là 415,25, kết hợp với số nguyên tử cacbon của chất 1 là 29 ta có thể dự đoán công thức phân tử là C29H50O. Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của chất 1 với các số liệu đã được công bố của
β-Sitosterol [42, 19] thấy hoàn toàn phù hợp. Như vậy, chất 1 có thể được khẳng định là β-Sitosterol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ
loài thực vật này.
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 1 3.2.2. Chất 2
Chất 2 được xác định cấu trúc dựa trên số liệu thực nghiệm đo phổ NMR và phổ MS, so sánh với tài liệu tham khảo.
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của chất 2
Phổ 1H-NMR của chất 2 cho một tín hiệu cộng hưởng dạng triplet tại δH
0.89 (t, J = 7.7 Hz, 3H) tương ứng với 3 proton của nhóm metyl liên kết với
một nhóm CH2. Một tín hiệu của triplet tại δH 3.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H) tương
ứng với 2 proton của nhóm metylen liên kết với một nhóm CH2 và liên kết với nguyên tử oxy.
Trên phổ có các tín hiệu cacbon tương ứng với nguyên tử C liên kết với oxi (δC = 62.93 ppm) và cacbon trong nhóm methyl (δC = 13.93 ppm) và các nguyên tử cacbon của các nhóm metylen được xác định dựa trên dữ liệu phổ DEPT-135.
Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của chất 2
Trên phổ tương quan hai chiều HSQC và HMBC ta nhận thấy các tín hiệu tương tác trực tiếp và gián tiếp của các nguyên tử cacbon và hidro. Kết hợp với phổ 1H, 13C-NMR của chất 2 và so sánh với các tài liệu tham khảo có thể dự đoán chất 2 là n-alcohol.
Hình 3.10. Phổ HSQC của chất 2
Hình 3.11. Phổ HMBC chất 2
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 481 [M+H]+ (100%) do đó công thức phân tử của n-alchol chất là C33H68O
Hình 3.12. Phổ khối lƣợng của 2
Căn cứ các giá trị phổ 1
H-NMR và 13C-NMR, và phổ tương quan hai chiều DEPT, HSQC, HMBC và phổ khối của chất 2 có thể kết luận chất 2 là tritriacontan-1-ol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thực vật này.
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của 2 3.2.3. Chất 3
Chất 3 là chất bột màu vàng nhạt, trên phổ 1H-NMR của chất 3 cho một tín hiệu cộng hưởng dạng singlet tại δH 6.93 ppm (2H) tương ứng với 2 proton trên nhân thơm, kết hợp với phổ HSQC của 3 nhận thầy 2 proton này liên kết với nguyên tử cacbon δC 109.2 ppm. Trên phổ DEPT-135 của 3 nhận thấy 2 proton này thuộc dạng liên kết trong nhóm CH, nên 2 proton trên có trong hai nhóm CH của nhân thơm. Nguyên tử hydro có δH 12.12 ppm có thể là proton của nhóm COOH và 2 proton có δH 9,19 ppm, 01 proton có δH 8.82 là các proton của nhóm OH trên nhân thơm.
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của chất 3
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của chất 3
Trên phổ 13C-NMR của chất 3 có 5 tín hiệu cộng hưởng, trong đó tín hiệu cộng hưởng có δC 167.92 ppm có thể là nguyên tử C-8, δC 109.2 ppm là 2 nguyên tử cacbon tương đương tại C-2 và C-6; δC 120.91 là nguyên tử cacbon
bậc 4 tại C-1; δC 145.85 ppm là 2 nguyên tử cacbon tương đương tại C-3 và C- 5; δC 138.4 ppm là nguyên tử C-4.
Hình 3.16. Phổ DEPT-135 của chất 3
Hình 3.18. Phổ HMBC của chất 3
Hình 3.19. Phổ khối lƣợng của 3
Trên phổ khối lượng của 3 có pic ion có m/z là 193.12 [M+Na]+. Kết hợp với phổ 13-NMR của 3 có thể dự đoán 3 có công thức phân tử là: C7H6O5. Qua phân tích phổ NMR 1D-, 2D-, kết hợp với tài liệu tham khảo [19, 34] ta có thể kết luận 3 là acid gallic, có công thức cấu tạo là:
Hình 3.20. Công thức cấu tạo của 3
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết cồn tổng số
Khả năng khử gốc tự do và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit là những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa invitro thường gặp nhất trong nghiên cứu [18], [24]. Ở luận văn này, chúng tôi cũng sử dụng các phương pháp phổ biến trên.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khả năng làm sạch gốc tự do DPPH và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng quét gốc tự do và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit càng lớn và ngược lại. Khả năng trung hòa 50% gốc tự do (SC50) và chỉ số ức chế (IC50) của phản ứng peroxy hóa lipit được trình bày ở bảng 3.3. Đặc biệt, các chỉ số SC50 và IC50 của mẫu thử trong 2 nghiên cứu đều thấp hơn chỉ số của Trolox (acid ascorbic). Kết quả trên cho thấy mẫu cao chiết đã thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh thông qua phép thử trung hòa gốc tự do DPPH và phép thử ức chế phản ứng peroxy hóa lipit não chuột [18], [24].
Bảng 3.3. Hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit của mẫu nghiên cứu
Nồng độ (µg/ml)
Phần trăm trung hòa gốc tự
do của DPPH (%) Phần trăm ức chế MDA (%)
Mẫu chiết Ascorbic
acid Mẫu chiết
Ascorbic acid 100 90,47 91,62 74,16 73,41 20 90,37 91,30 72,92 66,79 4 47,83 27,96 67,56 38,70 0,8 19,68 1,51 34,02 28,71 SC50/IC50 4,25 ± 0,40 7,80 ± 0,10 1,88 ± 0,25 7,53 ± 0,12
Chỉ số IC50 trong phản ứng peroxy hóa lipit của Nguyễn Thu Hằng [2] (IC50 sấp sỉ bằng 62,22 µg/ml) cao hơn rất nhiều so với IC50 trong luận văn này (IC50 = 1,88 ± 0,25 µg/ml). Điều đó chứng tỏ mẫu thử trong luận văn thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn rất nhiều so với hoạt tính trong nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng. Sự khác biệt đó có thể do sự khác nhau về mẫu thử: Mẫu của Nguyễn Thu Hằng là dịch chiết nước từ lá của loài Sambucus javanica, trong luận chúng tôi sử dụng cao khô với dung môi chiết là cồn 90%
và khác nhau về địa điểm thu hái nguyên liệu.
Khả năng quét gốc DPPH trong nghiên cứu này (SC50 = 4,25 ± 0,40 µg/ml) cao hơn rất nhiều khả năng quét gốc DPPH trong các nghiên cứu của A.Sidor & A.G.Michałowska [18] (SC50 = 60,2 mg/ml/acid ascorbic) và nghiên cứu của H.H.Xiao et al [25]. Nghĩa là hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết từ lá cây Sambucus javanica cao hơn rất nhiều so với dịch chiết từ hoa, quả của cây Sambucus nigra và acid linoleic chiết xuất từ dầu của hạt cây Sambucus williamsii. Điều này được giải thích là do sự khác nhau về loài thực vật và
khác nhau về mẫu nghiên cứu (cao chiết cồn 90% trong luận văn với dịch chiết nước từ hoa và quả trong nghiên cứu của A.Sidor & A.G.Michałowska).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Luận văn thạc sĩ “Xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính của một số hợp chất hóa học từ loài Cơm cháy (Sambucus javanica reinw)” thực hiện các nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất hữu cơ và thử hoạt tính sinh học của cao chiết cồn tổng số từ lá cây Cơm cháy. Luận văn đã hoàn thành các nhiệm vụ đề ra và đạt được các kết quả sau:
1- Đã định tính thành phần hóa học trong cao chiết cồn 90%.
2- Đã tiến hành sắc ký cột silica gel pha thuận, phân lập được 3 hợp chất từ lá của cây Cơm cháy.
3- Đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất được phân lập từ mẫu nghiên cứu 4- Đã đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế phản ứng
peroxy hóa lipit não chuột trong mô hình in vitro của cao chiết cồn.
2. Kiến nghị
Để cung cấp thêm thông tin khoa học, hữu ích về loài Cơm cháy, xin kiến nghị một số ý kiến sau:
1- Tiếp tục nghiên cứu thêm về thành phần hóa học của loài Cơm cháy (Sambucus javanica reinw).
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Viêt Nam. Nxb Y học, 1997, Tr.314-315. 2. Nguyễn Thu Hằng, “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và
một số tác dụng sinh học của chi Sambucus L. ở Việt Nam”, Luận án tiến
sỹ, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 2004.
3. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Chu Đình Kính, “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sambucus nigra ssp.canadensi (L.) R. Bolli (họ cơm
cháy Sambucaceae)”, Tạp chí dược liệu, tập 9, số 2/2004, Tr.39-42, 2004. 4. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Trần Vân Hiền, “Nghiên cứu tác dụng hạ
đường huyết của hoa cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp.canadensis (L.) R.Bolli)”, Tạp chí dược học, số 3+4/2004, Tr.13-14, 2004.
5. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Trần Vân Hiền, “Thăm dò tác dụng chống oxi hóa của flavonoid chiết từ cây tiếp cốt thảo (sambucus chinensis lindl)”, Tạp chí dược liệu, tập 3, số 4/1998, Tr.118-120, 1998.
6. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Viêt Nam. Nxb Trẻ, tập 3, 2000, Tr.223.
7. Chu Đình Kính, Phan Thanh Kỳ và Nguyễn Thu Hằng, “Xác định cấu trúc của hợp chất 2 (3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-3- YL-6-deoxy-4-0-hexopyranosyl-hexopyranoside-một flavonoid được phân lập từ hoa cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp.canadensis {L.} R.Bolli) bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân”, Tạp chí dược liệu, số
12/2003, Tr.12-15, 2003.
8. Phan Thanh Kỳ và Nguyễn Thu Hằng, “Tổng quan về flavonoid của chi
Sambucus L.”, Tạp chí thông tin y học, số 1/2004, Tr.11-13, 2003.
9. Phan Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên và Nguyễn Xuân Vinh, “Góp phần nghiên cứu loài Sambucus chinensis Lindl mọc tại Hưng yên”, Tạp chí dược học,
10. Đỗ Tất Lợi, Những vị thuốc và cây thuốc Viêt Nam. Nxb Khoa học Kỹ
thuật, 1977, Tr.297.
11. Trần Thị Thoan, “Nghiên cứu thành phần thực vật, Thành phần hóa học của cây Sambucus sp. (Caprifoliaceae)”, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ Đại
học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 2003.
12. Nuyễn Thị Thanh Thuỷ, “Tiếp tục nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Tiếp cốt thảo (Sambucus chinensis Lindl. Caprifoliaceae)”, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 2001.
13. Triệu Tú Trinh, Thanh thảo dược thái sắc đồ phổ. Nxb Khoa hoc Kỹ thuật Phúc Kiến, Tr 360 (tài liệu dich).
14. Nuyễn Thị Thái Vân, “Nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau của lá cây tiếp cốt thảo”, Tạp chí Y học thực hành, số 4, 2006, Tr.6-9.
15. Lương Y Hy Lãn Hoàng Văn Vinh, Cây thuốc vị thuốc Đông y. Nxb Hà
Nội, 2001.
16. Nguyễn Xuân Vinh, “Bước đầu nghiên cứu dược liệu Sambucus chinensis
Lindl. Caprifoliaceae”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 1997.
17. Vũ Văn Vụ, Hà Thị Thanh Bình, Trần Dụ Chi, Lê Hồng Điệp và Khúc Thị An, “Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học của cây Tiếp cốt thảo (Sambucus chinensis LindL.)”, Hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ
bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, tháng 07/2003, Tr. 417 - 420.
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
18. A.Sidor & A.G.Michałowska “Advanced research on the antioxidant and health benefit of elderberry (Sambucus nigra) in food – a review”, Journal
of Functional Foods, Volume 18, Part B, Pages 941-958, 2015.
19. B.Toulemonde & H.M.J.Richard, “Volatile Constituents of Dry Elder (Sambucus nigra L.) Flowers”, Food Chem, Vol 31, Issue 2, 1983.
20. C.Hyemin, L.Y.June, C.S.Young, R.W.Young & L.G.Dong “Isolation of (-)- olivil-9′-O-β-D-glucopyranoside from Sambucus williamsii and its antifungal effects with membrane-disruptive action”, Biochimica et Biophysica Acta, Volume 1828, Pages 2002–2006, 2013.
21. D.Beaux, J.Fleurentin & F.Mortier “Effect of extracts of Orthosiphon stamineus Benth, Hieracium pilosella L., Sambucs nigra L. and Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spring. In rats”, Phytotherapy Research,
Volume 13, Pages 222-225, 1999.
22. G.A.Hale, “Chapter 3.14: Elderberry (Sambucus nigra L.)”, Nonvitamin and Nonmineral Nutritional Supplements, G.A.Hale, Elsevier Inc., 2019,
Pages 211-215.
23. GNT USA, Inc, “National List Petition for Elderberry Juice Color, Elderberry Juice Color”, USDA National Organic Program, January 12, 2007.
24. H. X.Wang, H.Liu, M.J.Moore, ... & H.F.Wang, “Plastid phylogenomic insights into the evolution of the Caprifoliaceae s.l. (Dipsacales)”, Molec. Phyl.Evol, Vol. 142:106641, 2020. DOI:10.1016/j.ympev.2019.106641.
25. H.H.Xiao, Zh.Yan, C.Raymond, Y.Xin-Sheng & W.Man-Sao “Phytochemicals and potential health effects of Sambucus williamsii Hance (Jiegumu)”, Chin Med, Volume 11, Page 36, 2016.
26. H.Jessi, B.Colby, C.Lindsey & D.Elizabeth “Black elderberry (Sambucus
nigra) supplementation effectively treats upper respiratory symptoms: A
meta-analysis of randomized, controlled clinical trials”, Complementary Therapies in Medicine, Volume 42, Pages 361-365, 2019. DOI:10.1016
/j.ctim. 2018.12.004
27. J.B.Jaumandreu, F. Xavier & C.de las Heras, “Allelochemicals and esters from leaves and inflorescences of Sambucusnigra L.”, Phytochemistry
Letters, Volume 30, Pages 107-115, 2019.
29. M.Badescu, O.Badulescu, L.Badescu & M.Ciocoiu, “ Effects of Sambucus
nigra and Aronia melanocarpa extracts on immune system disorders within
diabetes mellitus”, Pharmaceutical Biology, Volume 53, Issue 4, Pages 533- 539, 2015.
30. M.Ciocoiu, D.Serban, L.Bădescu, D.Tutunaru, O.Badulescu & M.Bădescu, “The effects of Sambucus nigra extract in experimental arterial hypertension”, Annals of the Romanian Society for Cell Biology, Volume
15, Pages 87-92, 2010.
31. M.Ciocoiu, L.Badescu, D. Badulescu & M.Badescu, “Intervention of Sambucus nigra polyphenolic extract in experimental arterial hypertension”, World Academy of Science, Engineering and Technology, Volume 64, Pages 244-247, 2012a.
32. M.Groza, D.Jitaru, L.Bădescu, M.Ciocoiu & M.Bădescu, “Evaluation of the immune defense in diabetes mellitus using an experimental model”,
Romanian Biotechnology Letters, Volume 16, Pages 5971-5979, 2011.
33. M.M.Bratu, E.Doroftei, T.Negreanu-Pirjol, C.Hostina & S.Porta “Determination of antioxidant activity and toxicity of Sambucus nigra fruit extract using alternative methods”, Food Technology and Biotechnology, Volume 50, Pages 177-182, 2012.
34. M.M.Petkovsek, A.Ivancic, V.Schmitzer, R.Veberic & F.Stampar,
“Comparison of major taste compounds and antioxidative properties of
fruits and flowers of different Sambucus species and interspecific hybrids”,
food chemistry, Volume 200, Pages 134-140, 2016.
35. M.M.Petkovsek, V.Schmitzer, A.Slatnar,... & A.Ivancic “Investigation of Anthocyanin Profile of Four Elderberry Species and Interspecific Hybrids”,
Food Chem, Volume 62, Pages 5573−558, 2014.
36. M.Senica, F.Stampar, R.Veberic & M.M.Petkovsek“The higher the better? Differences in phenolics and cyanogenic glycosides in Sambucus
nigra leaves, flowers and berries from different altitudes”, Journal of the