Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số loài trong ch
1.2.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Những hoạt tính này gây ra từ sự đa dạng của hợp chất trong các loài của chi Cơm cháy. Nguời ta chú ý đặc biệt là các flavonoid chiết xuất từ các loài trong chi này. Mặc dù các flavonoid có ở tất cả các bộ phận của cây nhưng nổi bật nhất trong lá và vỏ cây.
Nghiên cứu trong nước của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Vinh[16], Phạm Thanh Kỳ [9] và Nguyễn Thu Hằng [5] nhận thấy flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá cây Sambucus chinensis Lindl có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn gram (-) và gram (+); tác dụng lên vi khuẩn Escherichia coli (vi khuẩn đường ruột); trực khuẩn Bacillus subtilis.
Trên thế giới, các nghiên của các tác giả C.Hyemin [20]; S.S.Won [43] đã đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất Pinoresinol, lariciresinol, (-) - olivil-9′-O-D-glucopyranoside và glochidioboside đều được phân lập từ
Sambucus williamsii, chúng thể hiện tác dụng kháng nấm đối với các chủng
gây bệnh ở người thông qua hành động phá vỡ màng tế bào. (+) - Medioresinol, một loại lignan (loại furofuran), được phân lập từ vỏ của thân cây Sambucus williamsii, cũng có tác dụng kháng nấm, nhưng thông qua sự tích tụ của các
loại phản ứng oxy hóa trong ty thể.
1.2.7. Hoạt tính chống loãng xƣơng
Bệnh loãng xương là tình trạng mật độ khoáng chất của xương giảm dưới ngưỡng bình thường làm cho xương mất đi sự khoẻ mạnh và dễ bị gãy. Bệnh
loãng xương thường gặp ở phụ nữ tuổi trung niên trở ra, nhưng bệnh cũng có thể gặp ở nam giới và trẻ em.
Điều trị chứng loãng xương bằng các chiết xuất từ thảo dược được nhiều nhà khoa học quan tâm. Trên thế giới các nghiên của tác giả H.H.Xiao và cộng sự [25], cho thấy: Chiết xuất ethanol từ thân cây Sambucus williamsii có tác
dụng chống loãng xương. Hơn nữa, các chất hữu cơ bao gồm lignan, acid phenolic và triterpenoids trong chiết xuất ethanol của thân cây Sambucus williamsii kích thích sự tạo xương bằng cách thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa
của nguyên bào xương.
1.2.8. Hoạt tính kháng vi-rút
Hoạt tính này đuợc cho là có liên quan trực tiếp đến sự phong phú của các hợp chất flavonoid trong chi Cơm cháy, đặc biệt là chiết xuất từ quả mọng của loài Sambucus nigra. Những phát hiện ban đầu này có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn kháng sinh mới và thuốc kháng vi rút.
Năm 2018, nghiên cứu của Jessie Hawkins và cộng sự[26] về khả năng kháng vi-rút của loài Sambucus nigra (Eldberry) cho thấy việc bổ sung
Eldberry đã làm giảm đáng kể các triệu chứng hô hấp trên. Những phát hiện này cho thấy khả năng kháng vi-rút của loài Sambucus nigra đối với bệnh cảm lạnh và cúm thông thường.
Năm 2029, Golnoosh Torabian và cộng sự[45], đã nghiên cứu xác định cơ chế hoạt động của dịch chiết từ quả cây Sambucus nigra và hợp chất hoạt động chính của nó (cyanidin-3-glucoside (cyn 3-glu)) trong việc chống lại vi-rút cúm. Chiết xuất từ quả Sambucus nigra có tác dụng ức chế nhẹ ở giai đoạn đầu của chu kỳ vi-rút cúm, có tác dụng mạnh hơn đáng kể (chỉ số điều trị là 12 ± 1,3) trong giai đoạn sau nhiễm trùng. Cơ chế được xác định là ngăn chặn glycoprotein của vi-rút cũng như làm tăng số lượng của IL-6, IL-8 và TNF
1.3. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài trong chi Cơm cháy
1.3.1. Hợp chất phenol
Hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong chi Cơm cháy. Chúng là một trong số các tác nhân chính quyết định nhều hoạt tính sinh học cho các loài trong chi này. Trong số các hợp chất phân lập được từ loài này thì một lượng lớn tồn tại trong cấu trúc lignan và các acid phenolic. Ngoài ra còn tồn tại dưới cấu trúc các coumarin.
Trong nước, theo nghiên cứu của Vũ Văn Vụ và cộng sự [17], trong cây
Sambucus chinensis Lindl có chứa coumarin.
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần của các hợp chất phenol từ một số loài trong chi Cơm cháy được trình bày trong các bảng 1.8 dưới đây.
Bảng 1.8. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp chất phenol từ các loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Hợp chất
Phần của thực
vật
Tác giả Tài liệu tham khảo Sambucus williamsii Lignan Toàn bộ cây O.Fu; C.Hyemin và S.S.Won [37], [20], [43] 13 acid phenolic Toàn bộ
cây O.Fu; C.Hyemin và S.S.Won [37], [20], [43] 1.3.2. Flavonoid
Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có hoạt tính sinh học cao. Một số tác dụng sinh học của nhóm chất này đã được công bố như: Tác dụng kháng khuẩn, chống viêm, chống oxi hóa, bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch, phòng và điều trị ung thư...
Flavonoid là lớp chất hữu cơ thường gặp trong các loài của chi Cơm cháy. Chúng tồn tại trong hầu hết các bộ phận của cây, nhưng có nhiều nhất trong quả mọng. Flavonoid trong chi Cơm cháy thường tồn tại dưới cấu trúc của
anthocyanin. Dưới đây là một số nghiên cứu trong nuớc và Quốc tế về nhóm hợp chất này trong chi Cơm cháy.
Bảng 1.9. Nghiên cứu trong nƣớc về thành phần hóa học của nhóm hợp chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Hợp chất Phần của
thực vật Tác giả Tài liệu tham khảo Sambucus chinensis Lindl flavonoid (khoảng 1,294 ± 0,068%) Bộ phận trên mặt đất của cây Nguyễn Thu Hằng [3] Hàm lượng cao nhất ở lá cây (3,628 ± 0,017% chất khô) và thấp nhất ở thân rễ (0,756 ± 0,032% chất khô), trong hoa chiếm (2,281 ± 0,031% chất khô) Lá, rễ, hoa Vũ Văn Vụ và cộng sự [17] Sambucus simpsonii Rehder
Trong thân chứa 0,402 ± 0,074%; trong lá chứa 3,054 ± 0,113%; trong hoa chứa 7,194 ± 0,104%. Thân, lá, hoa Trần Thị Thoa [11] Sambucus nigra Flavonoid ở hoa là 7,19%; ở lá là 3,06%; ở thân là 3,40%. Từ dịch chiết flavonoid toàn phần của hoa loài Sambucus nigra đã
phân lập được 3 chất tinh khiết: Quercetin; Quercetin- 3-α-rhamno-pyranosyl-β- glucopyranose; n-hexacosane . Hoa Nguyễn Thu Hằng [2] Sambucus javanica Kaemferol (1) Lá Nguyễn Thu Hằng [2]
(1)
Hình 1.2. Cấu trúc của Kaemferol
Bảng 1.10. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Tên hợp chất Phần của
thực vật Tác giả Tài liệu tham khảo Sambucus nigra Cyanidin-3-O- sambubiosyl-5-O- glucoside; Cyanidin-3,5-O-diglucoside; Cyanidin-glycoside 4 (cyanidin- pentoside-hexoside 4); Cyanidin-3-O-galactoside; Cyanidin-3-O-sambubioside; Cyanidin-3-O-glucoside, sterol Quả Maja Mikulic- Petkovsek và R.Veberic [35] [42] Sambucus javanica Cyanidin-3-O- sambubiosyl-5-O- glucoside (2); Cyanidin-3,5-O- diglucoside (3); Cyanidin- glycoside 4 (cyanidin- pentoside-hexoside 4) (4); ); Cyanidin-3-O-galactoside (5); Cyanidin-3-O-sambubioside (6); Cyanidin-3-O-glucoside (7) Quả Maja Mikulic- Petkovsek và cộng sự [35]
(2)
(3)
(4)
(7)
Hình 1.3. Công thức của các hợp chất thuộc nhóm anthocyanin phân lập đƣợc từ loài Sambucus javanica
1.3.3. Acid hữu cơ
Acid hữu cơ là nhóm hợp chất được tìm thấy ở hầu hết các bộ phân của các loài trong chi Cơm cháy như lá, thân, hoa, quả...đặc biệt có nhiều trong quả mọng. Một số acid được phân lập từ chi này thể hiện hoạt tính sinh học cao (như trình bày trong phần hoạt tính sinh học ở trên). Tổng hợp một số nghiên cứu nhằm xác định thành phân và cấu trúc một số acid hữu cơ trong chi Cơm cháy được trình bày dưới đây.
Bảng 1.11. Nghiên cứu trong nƣớc về thành phần hóa học của nhóm hợp chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Tên hợp chất Phần của
thực vật Tác giả Tài liệu tham khảo Sambucus chinensis Lindl Acid 1,2-Benzenedicarboxylic Lá Nguyễn Thị Thanh Thuỷ [12] Sambucus simpsonii Rehder
Acid hữu cơ
Thân, lá, hoa và quả Trần Thị Thoa [11] Sambucus
nigra Acid hữu cơ
Lá, thân, hoa và quả
Nguyễn Thu Hằng
Bảng 1.12. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Tên hợp chất Phần của
thực vật Tác giả Tài liệu tham khảo Sambucus chinensis Lindl Acid chlorogenic Toàn bộ cây Triệu Tú Trinh [13] Sambucus williamsii
Acid palmitic Hoa Bernard
Toulemonde1 và Hubert M. J. Richard [19] Sambucus nigra
16 acid hữu cơ Hoa
Bernard Toulemonde1
và Hubert M. J. Richard
[19]
Acid oleanolic Vỏ William
lawrie và cộng sự
[48]
Sambucus javanica
Acid Citric (8); acid Malic (9); acid Tartaric (10); acid Fumaric (11); acid Shikimic (12). Quả Maja Mikulic- Petkovsek và cộng sự [34]
(8)
(9) (10)
(11) (12)
Hình 1.4. Công thức của các acid hữu cơ đƣợc phân lập đƣợc từ loài loài
Sambucus javanica
1.3.4. Đƣờng khử
Đường khử là loại đường có chứa nhóm aldehyd (-CHO) hoặc nhóm ketone (-CO-). Chúng là những hợp chất phổ biến, được tìm thấy trong các loài thực vật khác nhau.
Tổng hợp các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài trong chi Cơm cháy, nhận thấy đường khử tập trung nhiều trong quả mọng.
Trong nước, nghiên cứu của Trần Thị Thoa [11], cho biết trong thân, lá, hoa và quả cây Sambucus simpsonii Rehder có đường khử tự do.
Trên thế giới, tác giả Maja Mikulic-Petkovsek và cộng sự [34], đã chiết xuất các chất chính trong quả mọng của loài Sambucus javanica thu được 3
(13) (14)
(15)
Hình 1.5. Công thức của các đƣờng khử đƣợc phân lập đƣợc từ loài loài Sambucus javanica
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị phân lập
2.1.1. Hóa chất
Các loại dung môi sử dụng để phân lập các chất đều tinh khiết, silicagel và lớp mỏng sạch.
Bảng 2.1. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong quá trình phân lập các chất
STT Hóa chất Xuất xứ
1 Dichloromethane Trung Quốc
2 n - Hexan Trung Quốc
3 Acetone Trung Quốc
4 Ethyl acetate Trung Quốc
5 Ethanol Trung Quốc
6 n - Butanol Trung Quốc
7 Silica gel cỡ hạt 230-400/mesh (Merck) Đức
8 Silica gel C18 (5-10/mesh, Merck) Đức
9
Thuốc hiện màu là dung dịch C2H5OH/H2SO4-Valilin
2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng
STT Thiết bị đã sử dụng Nơi sử dụng
1 Máy cất quay chân không Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
2 Máy đo khối phổ Mass Spectrometter (LC-MS)
Khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
3 Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
4 Cột sắc ký, cốc, ống nhiệm, bông... Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
5 Đèn UV 254nm Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên 6 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích
được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silica gel tráng sẵn (dài 0.2 mm)
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
7 Cân phân tích Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên 8 Các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm
phân lập chất hữu cơ
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc
2.2.1. Thu hái
Lá cây Cơm cháy được thu hái vào sáng ngày 20 tháng 6 năm 2019 tại gia đình Lương y Hoàng Văn Phiến, số nhà 017, tổ 43, phường Pom Hán, thành
phố Lào Cai, tỉnh Lào Cai (điện thoại liên hệ: 0356269373). Sau đó, mẫu được gửi đến PGS.TS Sỹ Danh Thường, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên định danh.
2.2.2. Xử lý và bảo quản
Lá cây Cơm cháy, sau khi lá được thu hái, loại bỏ phần lá sâu, lá già úa, lá giập lát, lá quá non, làm sạch, phơi ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50-600, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV) có trong ánh nắng mặt trời sẽ kích thích các phản ứng sinh hóa trong thực vật làm biến đổi thành phần hóa học.
Mẫu khô được bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu.
2.3. Chiết xuất cao
Cho 1500 gam (1.5kg) lá khô cây Cơm cháy, thêm 5 lít cồn 90%, cho vào dụng cụ chiết, nắp ống sinh hàn và duy trì nhiệt độ ở 700C. Chiết liên tục trong 4 giờ, lặp lại 3 lần. Cô quay dưới áp suất thấp, thu 200 gam cao đặc. Cao được được bảo quản trong tủ lạnh.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo cao chiết cồn tổng số
2.4. Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cao chiết cồn 2.4.1. Định tính polyphenol
Phản ứng với muối sắt (III): Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
Tác dụng với H2SO4 đặc: Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm; đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon.
1.5kg lá khô
Cây Cơm cháy Dịch chiết Cao chiết cồn (200g)
Etanol 90%
t0 = 70 , chiết trong 4h, lặp lại
3 lần
2.4.2. Định tính alkaloid
Thuốc thử Dragendorff
+ Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml dung dịch axit axetic 20%.
+ Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
Thuốc thử Mayer
+ Dung dịch A: hòa tan 1.36 g HgCl2 trong 60 ml H2O.
+ Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100ml.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc axit rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính.
Hiện tƣợng:
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam. + Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.4.3. Định tính các flavonoit
Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết thêm 10 ml CH3OH, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút đến và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoit.
Hiện tƣợng: Dịch chiết có màu hồng nhạt. Khi thêm thuốc thử thì có màu
2.4.4. Định tính các cumarin
Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một
trong hai ống đó 0.5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá ống nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.4.5. Phản ứng của Steroid (Phản ứng Liebermann - Burchardt)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn glycosid tim 1ml anhydrid
axetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0.5 ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tƣợng: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng
màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.5. Chiết phân đoạn từ cao chiết tổng số
Sử dụng phương pháp chiết Lỏng-Lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần DCM (dichloromethane), ethyl acetate (EA) và n-BuOH.
Cao chiết tổng số được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dung dịch này lần lượt với các dung môi: Dichlomethanr (DCM) (01 lít x 3 lần); ethyl acetate (01 lít x 3 lần); n-butanol (01lít x 3 lần).
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn 2.6. Phân lập hợp chất 2.6. Phân lập hợp chất
2.6.1. Phân lập hợp chất 1-2
Phần cao chiết DCM (45 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), cột sắc ký kích thước 7 x100 cm với 600 g silica gel. Ổn định cột bằng dung môi n – hexan. Hệ dung môi rửa giải là: n – hexan: acetone với tỉ lệ từ 15:1 – 1:2 (v/v), thu được 4 phân đoạn.