Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM
2.3. Chiết xuất cao
Cho 1500 gam (1.5kg) lá khô cây Cơm cháy, thêm 5 lít cồn 90%, cho vào dụng cụ chiết, nắp ống sinh hàn và duy trì nhiệt độ ở 700C. Chiết liên tục trong 4 giờ, lặp lại 3 lần. Cô quay dưới áp suất thấp, thu 200 gam cao đặc. Cao được được bảo quản trong tủ lạnh.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo cao chiết cồn tổng số
2.4. Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cao chiết cồn 2.4.1. Định tính polyphenol
Phản ứng với muối sắt (III): Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
Tác dụng với H2SO4 đặc: Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm; đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon.
1.5kg lá khô
Cây Cơm cháy Dịch chiết Cao chiết cồn (200g)
Etanol 90%
t0 = 70 , chiết trong 4h, lặp lại
3 lần
2.4.2. Định tính alkaloid
Thuốc thử Dragendorff
+ Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml dung dịch axit axetic 20%.
+ Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
Thuốc thử Mayer
+ Dung dịch A: hòa tan 1.36 g HgCl2 trong 60 ml H2O.
+ Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100ml.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc axit rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính.
Hiện tƣợng:
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam. + Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.4.3. Định tính các flavonoit
Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết thêm 10 ml CH3OH, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút đến và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoit.
Hiện tƣợng: Dịch chiết có màu hồng nhạt. Khi thêm thuốc thử thì có màu
2.4.4. Định tính các cumarin
Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một
trong hai ống đó 0.5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá ống nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.4.5. Phản ứng của Steroid (Phản ứng Liebermann - Burchardt)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn glycosid tim 1ml anhydrid
axetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0.5 ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tƣợng: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng
màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.5. Chiết phân đoạn từ cao chiết tổng số
Sử dụng phương pháp chiết Lỏng-Lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần DCM (dichloromethane), ethyl acetate (EA) và n-BuOH.
Cao chiết tổng số được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dung dịch này lần lượt với các dung môi: Dichlomethanr (DCM) (01 lít x 3 lần); ethyl acetate (01 lít x 3 lần); n-butanol (01lít x 3 lần).
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn 2.6. Phân lập hợp chất 2.6. Phân lập hợp chất
2.6.1. Phân lập hợp chất 1-2
Phần cao chiết DCM (45 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), cột sắc ký kích thước 7 x100 cm với 600 g silica gel. Ổn định cột bằng dung môi n – hexan. Hệ dung môi rửa giải là: n – hexan: acetone với tỉ lệ từ 15:1 – 1:2 (v/v), thu được 4 phân đoạn.
Tại phân đoạn 2, lọc chất rắn thu được 27 mg chất rắn 1, không màu. Tại phân đoạn 3, lọc chât rắn ở phân đoạn 3 và rửa lại với acetone thu
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập chất 1-2 2.6.2. Phân lập hợp chất 3 2.6.2. Phân lập hợp chất 3
Phần cao chiết n-butanol (35 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), cột sắc ký kích thước 6x50 cm với 500g silica gel. Hệ dung môi rửa giải là: chloroform : metanol với tỉ lệ từ 9:1 – 2:1 (v/v) thu được 5 phân đoạn.
Tại phân đoạn 2, tiến hành lọc chât rắn rửa lại với axeton thu được chất rắn 3, màu vàng nhạt, sấy khô, cân thu 10 mg chất 3.
Rửa lại bằng axeton, sấy khô
Cao DCM 45g Phân đoạn 1 (Không có chất rắn) Phân đoạn 2 (Có chất rắn) Phân đoạn 3 (Có chất rắn) Phân đoạn 4 (Có chất rắn) Chất rắn 1 Không màu, 27mg Chất rắn 2 Màu trắng, 35mg SKC
Rửa giải với hệ dung môi n-hexan:axeton từ 15:1-1:2(v/v)
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất 3 2.7. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các chất 2.7. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chiều HSQC và HMBC và phổ khối lượng ESI-MS tại Khoa Hóa học - Đại Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.8. Phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit não chuột
2.8.1. Vật liệu và hóa chất
Mẫu nghiên cứu là cao chiết ethanol. Rửa lại bằng axeton, sấy khô
Cao n-Butanol 35g
SKC
Hệ dung môi rửa giải: Chloroform: metanol với tỉ lệ từ 9:1– 2:1 (v/v) Phân đoạn 1 (Có chất rắn) Phân đoạn 2 (Có chất rắn) Phân đoạn 3 (có chất rắn) Phân đoạn 4 (có chất rắn) Chất rắn 3 Màu vàng nhạt, 10mg Phân đoạn 5 (Có chất rắn)
Hóa chất:
+ DPPH, Trolox (Sigma Aldrich): acid ascorbic (Fisher)
+ Đệm phosphat hoặc đệm KCl, Acid tricloacetic (TCA, Fisher) + Acid thiobarbituric (TBA) (Sigma Aldrich), FeSO4, H2O2
+ Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf),
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo máy đọc ELISA 96 giếng (Biotek)
Động vật: Chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm có khối lượng từ 23-26g.
2.8.2. Phƣơng pháp
* Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Được tiến hành theo phương pháp của Abramovič và cộng sự (2018) có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, cụ thể như sau:
Mẫu thử được pha dung dịch gốc trong methanol, sau đó được pha thành dải nồng độ thử mẫu với nước cất khử ion. Acid Ascorbic được sử dụng như chất đối chứng tham khảo và được pha thành dải nồng độ với nước cất khử ion.
DPPH pha trong methanol (100%) nồng độ 0,25 µM.
Hút mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào đĩa 96. Thêm dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có sẵn mẫu nghiên cứu (tỉ lệ 1:1)
Ống không có mẫu thử chỉ có 100 µl nước và 100 µl DPPH.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm.
Khả năng trung hòa gốc oxi hóa tự do (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%) Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
* Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa qua ức chế peroxy hóa lipid
Phương pháp chống oxi hóa thông qua ức chế quá trình peroxidation lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) được thực hiện theo phương pháp của Stroev EA, Makarova VG (1998), Jelili A Badmus et al., (2011) và của Viện Dược
liệu - Bộ Y Tế (2006), có sự thay đổi nhỏ cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm.
Pha mẫu thử:Cân mẫu sau đó pha thành các nồng độ 10.000 µg/ml, 2000 µg/ml, 400 µg/ml, 80 µg/ml, 16µg/ml nên sau khi cho 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 1 ml dịch đồng thể não và thêm 0,8 ml đệm phosphat, 0,1 ml hệ Fenton vừa đủ 2 ml thì nồng độ mẫu trong ống thử giảm xuống 20 lần còn 500 µg/ml, 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml; 0,8 µg/ml.
Cách tiến hành:
+ Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (pH=7,4) theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-4oC.
+ Lấy 1ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ và 0,8ml đệm phosphat thêm 0,1ml hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15mM theo tỉ lệ 1:1). Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 15 phút.
+ Dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Li tâm 12000 vòng trong 5 phút.
+ Lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% (theo tỉ lệ 2:1). Ủ ở nhiệt độ 100oC 15 phút.
+ Làm lạnh và tiến hành đo ở bước sóng λ = 532 nm. + Trolox được sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo.
Tính toán kết quả
+ Công thức tính phần trăm hoạt tính chống oxi hoá (HTCO) HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100
ODC : Mật độ quang học của giếng chứng không có mẫu thử ODT : Mật độ quang học của mẫu thử
+ Giá trị IC50 (Inhibition Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính các nhóm chất của cao chiết tổng số
Kết quả định tính nhóm chất trong dịch chiết etanol 90% của loài thực vật này được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ Số TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Số TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả
1 Phenolic dd FeCl3 5% Xanh
H2SO4 đặc Màu hồng
2 Alkaloid Dragendoff Không rõ
Mayer Không rõ
3 Flavonoid Mg/HCl đặc Xuất hiện màu đỏ nhạt
4 Coumarin Dung dịch NaOH
10%. Có vẩn đục màu vàng nhạt 5 Steroid Phản ứng Liebermann - Burchardt Có nhiều bọt
Từ kết quả ở Bảng 3.1 trên ta thấy trong dịch chiết etanol của loài thực vật có mặt nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, như phenolic, flavonoid, coumarin, steroid. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong việc ứng dụng làm thuốc chữa bệnh: flavonoid có tác dụng chống oxi hóa, tác động lên enzim, các bệnh tim mạch; hợp chất phenol có tác dụng kháng sinh, chống viêm; steroid có tác động tới hệ thần kinh, điều trị ung thư, diệt khuẩn, hạ huyết áp; coumarin có tác dụng chống đông máu, giảm đau, loãng xương, làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt, một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật…. Đây là cơ sở để tiến hành các nghiên
3.2. Kết quả xác định cấu trúc 3.2.1. Chất 1 3.2.1. Chất 1
Kết quả dữ liệu phổ của chất 1 được tổng hợp ở Bảng 3.2 và các hình dưới đây. Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 1 Ví trí Số liệu đo 13 C NMR (ppm)
Số liệu tham khảo 13C - NMR (ppm) của β-Sitosterol [42, 19] 1 H NMR (ppm), J (Hz) 1 37.10 37.51 1.55-1.75 (m) 2 35.99 31.90 1.18-1.68 (m) 3 71.64 72.01 3.48 (m) 4 42.16 42.50 1.47-1.57 (m) 5 140.59 140.91 6 121.55 121.9 5.27 (br d, 3.7) 7 31.75 32.10 1.45-1.65 (m) 8 31.63 32.11 1.77 (m) 9 49.97 50.32 1.76 (m) 10 36.35 36.74 11 20.94 21.35 1.56 (m); 1.67 (m) 12 39.79 39.96 1.56 (m); 1.64 (m) 13 42.17 42.67 14 56.60 56.93 2.04 (m) 15 24.14 26.34 16 28.11 28.56 17 55.9 56.37 18 11.88 13.38 0.76 (s) 19 19.24 19.25 0.94 (s) 20 33.77 34.24 21 25.83 26.33 0.73 (d, 6.7) 22 45.68 45.85 1.16 -1.19 (m) 23 22.91 23.32 1.76-1.84 (m) 24 11.89 12.28 1.87 (m) 25 29.0 29.46 1.86 (m); 1.89 (m) 26 19.66 20.15 0.8 (t, 6.6) 27 18.88 19.66 1.98 (m) 28 18.62 19.07 0.87 (d, 8.4) 29 11.70 12.08 0.62 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của 1 thấy xuất hiện tín hiệu của nguyên tử H-3 liên kết với nhóm β-OH (δH 3.48, m). Trên phổ cộng hưởng proton của 1 cũng xuất hiện của H trong liên kết bội tại H-6 tại δH 5.29 (br d, 3.7). Tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm methyl bậc ba
cộng hưởng tại δH 0.77 (s), 0.96 (s); 3 nhóm methyl bậc hai cộng hưởng tại δH 0.62 (d, J = 6.7 Hz), 0.73 (d, J = 6.7 Hz), δH 0.87 (3H, d, J = 8.4 Hz) và 1
nhóm thế methyl bậc một tại δH 0.8 (t, J = 6.6 Hz). Các tín cộng hưởng của các nguyên tử hidro khác của hợp chất 1 được thể hiện trong bảng 3.2.
Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1
Phổ 13C-NMR của chất 1 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín hiệu của hai cặp olefin được xác nhận tại C-5 (δC 140.59)/C-6 (δC 121.55)
ppm. Nguyên tử cacbon ở vị trí số 3 cộng hưởng tại δC 71.65 ppm. Các nhóm methyl bậc 3 cộng hưởng tại 11.88 (C-18) và 19.24 ppm (C-19). Qua phổ HSQC, HMBC sự quy kết các tín hiệu của các nguyên tử hidro và cacbon trong hợp chất 1 thể hiện chi tiết trong Bảng 3.2.
Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1
Hình 3.5. Phổ khối lƣợng của chất 1
Trên phổ khối lượng của chất 1 nhận thầy có píc m/z của [M+H]+ là 415,25, kết hợp với số nguyên tử cacbon của chất 1 là 29 ta có thể dự đoán công thức phân tử là C29H50O. Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của chất 1 với các số liệu đã được công bố của
β-Sitosterol [42, 19] thấy hoàn toàn phù hợp. Như vậy, chất 1 có thể được khẳng định là β-Sitosterol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ
loài thực vật này.
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 1 3.2.2. Chất 2 3.2.2. Chất 2
Chất 2 được xác định cấu trúc dựa trên số liệu thực nghiệm đo phổ NMR và phổ MS, so sánh với tài liệu tham khảo.
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của chất 2
Phổ 1H-NMR của chất 2 cho một tín hiệu cộng hưởng dạng triplet tại δH
0.89 (t, J = 7.7 Hz, 3H) tương ứng với 3 proton của nhóm metyl liên kết với
một nhóm CH2. Một tín hiệu của triplet tại δH 3.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H) tương
ứng với 2 proton của nhóm metylen liên kết với một nhóm CH2 và liên kết với nguyên tử oxy.
Trên phổ có các tín hiệu cacbon tương ứng với nguyên tử C liên kết với oxi (δC = 62.93 ppm) và cacbon trong nhóm methyl (δC = 13.93 ppm) và các nguyên tử cacbon của các nhóm metylen được xác định dựa trên dữ liệu phổ DEPT-135.
Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của chất 2
Trên phổ tương quan hai chiều HSQC và HMBC ta nhận thấy các tín hiệu tương tác trực tiếp và gián tiếp của các nguyên tử cacbon và hidro. Kết hợp với phổ 1H, 13C-NMR của chất 2 và so sánh với các tài liệu tham khảo có thể dự đoán chất 2 là n-alcohol.
Hình 3.10. Phổ HSQC của chất 2
Hình 3.11. Phổ HMBC chất 2
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 481 [M+H]+ (100%) do đó công thức phân tử của n-alchol chất là C33H68O
Hình 3.12. Phổ khối lƣợng của 2
Căn cứ các giá trị phổ 1
H-NMR và 13C-NMR, và phổ tương quan hai chiều DEPT, HSQC, HMBC và phổ khối của chất 2 có thể kết luận chất 2 là tritriacontan-1-ol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thực vật này.