Theo tính chất đã biết của các nhĩm chất terpen, flavonoid là tan tốt trong các dung mơi hữu cơ như EtOH, MeOH…Theo các tài liệu tham khảo [6, 40, 41], chúng tơi lựa chọn hỗn hợp dung mơi chiết là EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại và thân thiện với mơi trường hơn MeOH.
Đối với các mẫu thử R. officinalis, chúng tơi đã khảo sát và đưa ra phương pháp xử lý mẫu như sau:
phút. Ép bã dược liệu thu được các dịch chiết. Các dịch chiết này được hịa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichloromethane để loại tạp chất thu được các dịch chiết dichlometane, để lắng 24h, gạn và lọc thu được dịch lọc. Cơ loại dung mơi các dịch lọc dưới áp suất thu được các cao đặc. Hịa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC.
Chiết hồi lƣu: Cân chính xác các mẫu dược liệu (thân và lá R. officinalis) cho vào bình cầu, chiết nĩng bằng đun sơi hồi lưu với EtOH 70 (khoảng 200 ml), đun sơi nhẹ trong 3h (chiết 3 lần). Thu các dịch chiết và ép bã dược liệu. Dịch chiết EtOH được hịa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichlometane thu được các dịch chiết dichloromethane, để lắng, gạn và lọc thu được dịch lọc. Cơ loại dung mơi dịch lọc dưới áp suất thu được cao đặc. Hịa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật chiết gồm cĩ: + Dung mơi chiết xuất
+ Phương pháp chiết xuất + Thời gian chiết và số lần chiết
+ Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/dược liệu
2.3.4.1. Khảo sát tỷ lệ dung mơi chiết
Tiến hành khảo sát chiết với cả hai loại hỗn hợp dung mơi hữu cơ MeOH/H2O, EtOH/H2O theo các tỷ lệ biến đổi t 100% - 20%. Các dịch chiết thu được ứng với t ng khảo sát được tiến hành phân tích định lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 theo phương pháp HPLC-DAD. Hàm lượng các hoạt chất này trong dịch chiết là tiêu chí đánh giá hiệu quả chiết, t đĩ chọn ra được điều kiện chiết tối ưu. Mỗi khảo sát được tiến hành thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.4.2. Phương pháp chiết xuất
Trong phạm vi phịng thí nghiệm, hai phương pháp chiết được lựa chọn để khảo sát là: chiết siêu âm và chiết hồi lưu.
Chiết siêu âm: Sĩng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt – gây ra sự khuếch tán vào trong dung mơi của các chất cần chiết xuất. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, đơn giản, dễ sử dụng. Tuy nhiên, phương pháp cĩ nhược điểm là dịch chiết nhiều tạp.
Chiết nĩng: Sử dụng dung mơi để chiết nĩng các hoạt chất t dược liệu đã nghiền nhỏ trong bình cầu bằng phương pháp đun hồi lưu. Ưu điểm là hiệu suất chiết cao, dịch chiết thu được ít tạp chất hơn so với phương pháp chiết siêu âm, tuy nhiên hệ thống chiết phức tạp hơn.
2.3.4.3. Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến độ tan của một chất, vì vậy nhiệt độ chiết ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hịa tan chất định phân trong dung mơi chiết. Đối với chiết hồi lưu, nhiệt độ chiết thường được chọn là nhiệt độ sơi của dung mơi dùng để chiết xuất. Đối với chiết siêu âm, các bể chiết siêu âm hiện nay thường cĩ khoảng nhiệt độ làm việc t 300C đến 500C, vì vậy, lựa chọn khoảng 300C-500C để tiến hành khảo sát trong điều kiện cố định như sau:
+ Hệ dung mơi chiết: EtOH/H2O (70/30) + Thời gian chiết: 30 phút
+ Khối lượng dược liệu: 1 g + Thể tích dung mơi: 50 ml
Mỗi khảo sát được làm lặp lại 3 lần.
2.3.4.4.Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết / khối lượng dược liệu
Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/khối lượng dược liệu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết xuất hoạt chất ra khỏi nền mẫu dược liệu. Nếu sử dụng lượng thể tích dung mơi chiết ít, một phần lớn dung mơi bị ngấm vào dược liệu, dịch chiết thu được ít dẫn đến hiệu suất chiết thấp. Ngược lại, nếu sử dụng lượng thể tích dung mơi chiết lớn, cĩ thể chiết kiệt lượng chất định phân cĩ trong mẫu thử, nhưng cũng cĩ thể dẫn tới xuất hiện nhiều tạp chất gây cản trở quá trình phân tích và phát hiện chất. Hơn nữa, việc sử dụng thể tích dung mơi chiết lớn gây tốn kém về mặt kinh tế. Chính vì vậy, việc khảo sát lựa chọn tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/dược liệu tối ưu là cần thiết. Các tỉ lệ dung mơi (ml) – dược liệu (g) được lựa chọn khảo sát trong phương pháp chiết bao gồm: 30:1, 50:1, 70:1 và 90:1.
2.3.4.5. Khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết cũng cĩ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Nếu thời gian chiết dài gây tốn kém về mặt kinh tế, đồng thời cĩ thể dẫn tới việc xuất hiện các tín hiệu tạp chất. Thời gian chiết được khảo sát như sau:
+ Hệ dung mơi chiết: EtOH/H2O (70/30) + Khối lượng dược liệu: 1 g
+ Thể tích dung mơi: 50 ml + Nhiệt độ chiết 70oC
+ Khảo sát thời gian chiết trong 1h, 2h, 3h, 4h và 5h.
2.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy chấp nhận được.
Cách khảo sát: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu đối chiếu RO1 cĩ nồng độ 1 mg/ml vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký.
Yêu cầu: số đĩa lý thuyết 2000, giá trị RSD của thời gian lưu 1% và của diện tích pic phải 2% (với phép thử định lượng). Trường hợp RSD 2% phải cĩ sự giải thích phù hợp. Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS 1,5).
2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu
Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi cĩ mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hố, tạp chất… Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã tìm được trên mẫu thử lá
R. officinalis ở Hưng yên và mẫu đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 cĩ nồng độ 1 mg/ml. Ghi lại sắc ký đồ (SKĐ).
2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Pha một dãy các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ chính xác, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, lấy kết quả về diện tích pic và dựng đường chuẩn để thu được phương trình hồi quy. Yêu cầu phương trình hồi quy cĩ R> 0,99.
Đánh giá phương trình hồi quy: xây dựng các phương trình đường chuẩn trên phần mềm minitab 19. Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher.
T phương trình đường chuẩn xây dựng được, với độ lệch chuẩn SD thu được trên bảng phân tích ANOVA, tính tốn được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của đường chuẩn (CDL và CQL) theo các cơng thức tính như sau:
CDL = 3.SD/b → CDQ = 3,3 x CDL
Trong đĩ: SD là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn; b là độ dốc của đường chuẩn.
2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp
Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được t nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mơ tả.
Khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ưu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lưu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Dung dịch khảo sát là một mẫu cĩ nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn đã xây dựng, được bơm vào hệ 6 lần sau đĩ lấy diện tích pic và thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng được khảo sát và đánh giá. Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu được cân khối lượng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý được bơm 3 lần để thu được kết quả trung bình. Các giá trị trung bình đĩ được sử dụng để đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng được dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu
Yêu cầu: Với phép thử định lượng: giá trị RSD 2,0%. Các trường hợp giá trị RSD > 2%, cần phải cĩ sự giải thích phù hợp.
2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi)
Độ đúng cĩ thể được đánh giá qua sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực hoặc được chấp nhận thực. Đánh giá độ đúng thơng qua độ thu hồi.
Cách khảo sát: Tiến hành thêm 1 lượng xác định chất RO1 vào mẫu thử (lá
R. officinalis Hưng Yên) sao cho nồng độ chất RO1 đĩ vẫn nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành đo các dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn - Dung dịch mẫu thử
- Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn ở các mức khác nhau vào trong mẫu thực và tiến hành chiết tách như với mẫu thực. Tính độthu hồi theo cơng thức:
R% = . 100% Trong đĩ:
R%: độ thu hồi
Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ct+c: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Ct: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Yêu cầu: Theo AOAC, mẫu phân tích cĩ hàm lượng chất phân tích 1% độ thu hồi yêu cầu nằm trong khoảng 97-103%.
Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả
Tính tốn dựa trên các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng với sự hỗ trợ tính tốn của phần mềm Minitab 17.
- Giá trị trung bình: ̅ = ∑ - Phương sai: S2 = ∑ ̅ - Độ lệch chuẩn: SD = √∑ ̅
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) =
2.5. Phân tích mẫu thực tế
Mẫu thử sau khi được xử lý thu được dung dịch chạy sắc ký HPLC. Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng (%) của các hoạt chất chính tính theo dược liệu khơ tuyệt đối được tính theo cơng thức (1):
Hàm lượng (%) = (1)
Trong đĩ: C là nồng độ của hợp chất trong dung dịch mẫu thử tính theo phương trình hồi quy (mg/ml); V là thể tích pha lỗng của dung dịch mẫu thử (ml); m là khối lượng mẫu thử đem phân tích (g) .
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thơng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập đƣợc
* 7α-methoxyrosmanol
Chất bột vơ định hình, màu trắng.
Cơng thức phân tử C21H28O5, M = 360,44.
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất RO1 (đo trong CDCl3) xuất hiện bốn tín hiệu của nhĩm methyl trong đĩ cĩ hai tín hiệu singlet tại δH 1,01 (3H, s) và δH 0,93 (3H, s), hai tín hiệu doublet tại δH 1,22 (3H, d, J = 7,0 Hz) và δH 1,21 (3H, d, J = 7,0 Hz). Bên cạnh đĩ cịn xuất hiện một tín hiệu proton gắn vịng thơm tại δH 6,81 (1H, s). Hai tín hiệu doublet tại δH 4,26 và 4,71 (J = 3,0 Hz. Ngồi ra, phổ 1H-NMR cịn cĩ một tín hiệu singlet ở δH 3,66 cho thấy hợp chất là một dẫn xuất methoxy của rosmanol.
Trên phổ 13C-NMR của RO1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon,
trong đĩ cĩ năm carbon methyl tại C 22,2; 22,4; 22,0; 31,5; 58,2 (C nhĩm methoxy); ba carbon methylene tại C 27,1; 19,0; 38,0; năm carbon methine tại C 51,0; 74,9; 77,4; 27,3; 121,1 (carbon ở trong vịng thơm) và tám nguyên tử carbon khơng liên kết trực tiếp với nguyên tử hydro tại C 31,4; 126,0; 125,0; 47,1; 143,6; 141,3; 134,9; một nhĩm carbonyl ở vị trí 179,6.
Phân tích phổ NMR của hợp chất RO1 cho thấy số liệu phổ của hợp chất này tương tự với số liệu phổ đã cơng bố của 7α-methoxy rosmanol .
Do đĩ, hợp chất RO1 được xác định là 7α-methoxy rosmanol [5].
T các dữ liệu giải phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và các số liệu được trình bày ở bảng 3.1 đã kh ng định chắc chắn cơng thức phân tử của hợp chất này. Cơng thức cấu tạo của chất RO1 được trình bày ở hình 3.1.
Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo
Vị trí δC [5] δCa,b δHa,c (độ bội, J = Hz)
1 27,0 27,1 1,98 (dd; 5,0; 10,0; 14,0) 3,15 (m) 2 19,0 19,0 1,51 (m) / 1,66 (m) 3 38,0 38,0 1,20 (m) / 1,43 (m) 4 31,3 31,4 - 5 51,1 51,0 2,24 (s) 6 75,0 74,9 4,71 (d; 3,0) 7 77,6 77,4 4,26 (d; 3,0) 8 125,9 126,0 - 9 124,8 125,0 - 10 47,2 47,1 - 11 143,5 143,6 - 12 142,0 141,3 - 13 135,6 134,9 - 14 120,8 121,1 6,81 (s) 15 27,1 27,3 3,12 (m) 16 22,2 22,2 1,21 (d; 7,0) 17 22,5 22,4 1,22 (d; 7,0) 18 22,0 22,0 0,93 (s) 19 31,5 31,5 1,01 (s) 20 179,9 179,6 7-OMe 58,2 58,2 3,66 (s)
Tương tự, dựa trên các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và các tài liệu tham khảo, 10 chất đã được phân lập gồm cĩ 7α-methoxyrosmanol (RO1); carnosol (RO2); demethylsalvicanol (RO3); sageone (RO5); 20- deoxocarnosol (RO6); 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13-triene (RO7); rosmanol (RO8); 7 -methoxyrosmanol (RO9); 7α-ethoxyrosmanol (RO10); rosmarinoside A (RO4). Trong đĩ RO4 là một hợp chất mới và RO3, RO6, RO7 lần đầu tiên được phân lập t chi Rosmarinus. 10 hợp chất tách được t lồi R. officinalis đã được xác định như ở bảng 3.2và 3.3.
Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t lồi R. officinalis 7α-methoxyrosmanol (RO1) [5] Carnosol (RO2) [56] Demethylsalvicanol (RO3) [24] Rosmarinoside A (new) RO4 [56] Sageone (RO5) [49] Chất bột vơ định hình, màu trắng Chất rắn kết tinh màu trắng Chất bột vơ định hình, màu trắng.
Chất dạng dầu, màu vàng Chất dạng dầu, màu trắng
Bảng 3. 3.Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t lồi R. officinalis 20-deoxocarnosol (RO6) [35] 11,12,20-trihydroxy- abieta-8,11,13-triene (RO7) [26] Rosmanol (RO8) [23, 33] 7β-methoxyrosmanol (RO9) [5] 7α-ethoxyrosmanol (RO10) [23] Tinh thể rắn, màu vàng nhạt
Chất dạng dầu, màu vàng Chất rắn vơ định hình màu nâu
Chất dạng dầu, màu vàng Chất bột vơ định hình màu vàng nâu
3.2. Nghiên cứu tối ƣu hĩa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký
Qua các tài liệu tham khảo ta thấy bốn hợp chất được tách t lồi R. officinalis L. là 7α-methoxyrosmanol (RO1), 7β-methoxyrosmanol (RO9), demethylsalvicanol (RO3), 7α-ethoxyrosmanol (RO10) cĩ nhiều tác dụng sinh học như chống oxi hĩa, khả năng chống ung thư, điều trị béo phì, tiểu đường [7, 19, 24, 57]. Và hàm lượng của 4 chất này tách t lồi R. officinalis L. nhiều hơn so với các chất khác. Vì vậy, trong nghiên cứu này tơi tập trung vào xây dựng quy trình định lượng 4 hợp chất RO1, RO3, RO9 và RO10.
3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC
3.2.1.1. Khảo sát bước sĩng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu
Tiến hành khảo sát khả năng hấp thụ ánh sáng vùng UV-VIS của t ng hợp chất bằng hệ thống thiết bị HPLC detector DAD thu được kết quả ở hình 3.2.
RO1 RO3
RO9 RO10
T hình 3.2 cho thấy, phổ hấp thụ của các hợp chất là gần giống nhau, cùng cĩ đỉnh hấp thụ cực đại tại 290 nm. Điều này được giải thích bởi cấu trúc hĩa học của chúng khá là giống nhau. Bước sĩng 290 nm cho thấy các chất cĩ khả năng hấp thụ tốt, nhạy, pic cân đối, giảm được sự ảnh hưởng của nền. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tơi lựa chọn bước sĩng 290 nm để theo dõi, phát hiện 4 chất RO1, RO3, RO9 và RO10.
3.2.1.2. Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải
Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Trong sắc ký, pha động cĩ thể ảnh hưởng tới: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu của chất