CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ
- Micropipet các cỡ: 100, 200, 1000 l (Eppendorf, Đức) - Bình cầu đáy bằng, đáy trịn các cỡ (Isolab, Đức) - Phễu lọc thuỷ tinh
- Sinh hàn hồi lưu - Nhiệt kế
- Cốc thuỷ tinh 50 ml, 100 ml - Bình tia, vial
- Cột sắc ký pha thường và pha đảo các loại đường kính - Sinh hàn hồi lưu
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đĩ tráng bằng MeOH và để khơ, tráng n-hexane 3 lần sau đĩ sấy ở 105 trong vịng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng.
Thiết bị
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100HP với detector DAD (Mỹ)
- Cột pha đảo C18 YMC (150 mm x 4,6 mm; 5 ) (Nhật Bản) - Máy siêu âm Elmasonic S300H (Đức)
- Cân phân tích 4 số AL204 Mettler Toledo - Tủ sấy
- Tủ hút
- Máy cất quay chân khơng Eyela N-1200A (Nhật Bản) - Đèn tử ngoại hai bước sĩng 254 và 368 nm UVGL-58 (Mỹ) - Bếp điện
- Các dụng cụ khác
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất
Thân và lá R. officinalis (Đà Lạt) sau khi sấy khơ, nghiền thành bột mịn (1 kg), sau đĩ chiết với methanol (3 lần x 10L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần
1 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm thu được 156 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hịa tan vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane và EtOAc thu được cặn
n-hexane (ROH, 36,0 g), cặn EtOAc (ROE, 85,0 g) và lớp nước (ROW, 35,0 g) sau khi cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm.
Phân đoạn ROH được phân bố đều trong MeOH, tẩm với silica gel, quay khơ loại bỏ dung mơi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung mơi rửa giải gradient n-hexane:EtOAc (100:0 → 0:1, v/v) thu được năm phân đoạn chính, RO1A-RO1E. Phân đoạn RO1B được phân tách trên cột sắc ký silica gel với hệ dung mơi rửa giải n-hexane-EtOAc (8:1, v/v) thu được năm phân đoạn, RO3A- RO3E.
Phân đoạn RO3C được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (2:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, RO4A, RO4B, RO4D và hợp chất RO3 (21,0 mg). RO4A tiếp tục được đưa lên đưa lên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (2:1, v/v) thu được hợp chất RO1 (12,6 mg) và RO2 (7,3 mg).
Phân đoạn RO3A được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (2,5:1, 3:1, 4:1, v/v) thu được năm phân đoạn, RO6A-RO6E. RO6C tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO4 (3,3 mg) và RO5 (3,0 mg). Phân
đoạn RO6D được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO6 (10,0 mg) và RO7 (17,6 mg).
Phân đoạn RO3E được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (2,5:1, v/v) thu được bốn phân đoạn, RO7A-RO6D. RO6A tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO8 (45,6 mg). Phân đoạn RO7B được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO9 (29,0 mg). Phân đoạn RO7C được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung mơi rửa giải acetone:nước (4:1, v/v) thu được hợp chất RO10 (27,2 mg).
Quy trình phân lập các hợp chất được tĩm tắt qua hình 2.1. 1
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất
Xác định cấu trúc chất phân lập thơng qua việc phân tích các phổ cộng hưởng t hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), phổ HSQC và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo [3].
Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hố học ( ) của các proton được xác định trong thang t 0-14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hố của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của t ng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một t trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hố học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân t với nhau mà người ta cĩ thể xác định được cấu trúc hố học của hợp chất.
Phổ 13C-NMR: phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử
cacbon sẽ cộng hưởng ở một t trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (t 0-240 ppm).
Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các
tương tác của các hạt nhân t của phân tử trong khơng gian hai chiều. Một số kỹ thuật thường dùng:
Phổ HMQC – heteronuclear multiple quantum coherence: Các tương tác
trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các pic giao nhau trên phổ HMQC. Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR cịn trục kia là 13C-NMR.
Phổ HMBC – heternuclear multiple bond connectivity: là phổ biểu diễn
các tương tác xa của C và H trong phân tử.
Phổ cộng hưởng t hạt nhân NMR (1D, 2D-NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz cho 1H-NMR với TMS làm chất nội chuẩn và 125 MHz cho 13C- NMR với tín hiệu dung mơi làm chất chuẩn nội. Thiết bị đo được đặt tại Viện Hĩa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3.3. Tối ưu hĩa điều kiện hệ thống sắc ký
Phép phân tích định lượng các hoạt chất chính trong R. officinalis được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, kết hợp với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, bộ trộn dung mơi và detector DAD.
Detector là một bộ phận cĩ vai trị theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động t cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nĩ là một bộ phận thu nhận và phát hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đĩ của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện nay mảng diot – array (DAD) phát triển, chúng cĩ vai trị như một detector UV – VIS. Vì vậy, detector DAD được dùng để định lượng các hoạt chất chính trong R. officinalis.
Cột tách cĩ vai trị rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nĩ quyết định hiệu quả tách của quá trình. Để chọn được một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm như: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích được pha trong mơi trường như thế nào, cĩ pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Do các chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh cĩ bản chất kém phân cực giống như chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP- HPLC là lựa chọn tối ưu nhất. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng cột tách pha đảo C18 YMC (250 mm x 4,6 mm; 5 ) để tách các hợp chất và định lượng chúng.
Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC được tĩm tắt như sau: - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector diod array DAD.
- Thể tích tiêm mẫu: t 1 μl đến 10 μl. - Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
- Hệ thống dung mơi: khảo sát các hệ MeOH/H2O và ACN/H2O. - Rửa giải theo chương trình gradient.
2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu
Theo tính chất đã biết của các nhĩm chất terpen, flavonoid là tan tốt trong các dung mơi hữu cơ như EtOH, MeOH…Theo các tài liệu tham khảo [6, 40, 41], chúng tơi lựa chọn hỗn hợp dung mơi chiết là EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại và thân thiện với mơi trường hơn MeOH.
Đối với các mẫu thử R. officinalis, chúng tơi đã khảo sát và đưa ra phương pháp xử lý mẫu như sau:
phút. Ép bã dược liệu thu được các dịch chiết. Các dịch chiết này được hịa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichloromethane để loại tạp chất thu được các dịch chiết dichlometane, để lắng 24h, gạn và lọc thu được dịch lọc. Cơ loại dung mơi các dịch lọc dưới áp suất thu được các cao đặc. Hịa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC.
Chiết hồi lƣu: Cân chính xác các mẫu dược liệu (thân và lá R. officinalis) cho vào bình cầu, chiết nĩng bằng đun sơi hồi lưu với EtOH 70 (khoảng 200 ml), đun sơi nhẹ trong 3h (chiết 3 lần). Thu các dịch chiết và ép bã dược liệu. Dịch chiết EtOH được hịa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichlometane thu được các dịch chiết dichloromethane, để lắng, gạn và lọc thu được dịch lọc. Cơ loại dung mơi dịch lọc dưới áp suất thu được cao đặc. Hịa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật chiết gồm cĩ: + Dung mơi chiết xuất
+ Phương pháp chiết xuất + Thời gian chiết và số lần chiết
+ Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/dược liệu
2.3.4.1. Khảo sát tỷ lệ dung mơi chiết
Tiến hành khảo sát chiết với cả hai loại hỗn hợp dung mơi hữu cơ MeOH/H2O, EtOH/H2O theo các tỷ lệ biến đổi t 100% - 20%. Các dịch chiết thu được ứng với t ng khảo sát được tiến hành phân tích định lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 theo phương pháp HPLC-DAD. Hàm lượng các hoạt chất này trong dịch chiết là tiêu chí đánh giá hiệu quả chiết, t đĩ chọn ra được điều kiện chiết tối ưu. Mỗi khảo sát được tiến hành thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.4.2. Phương pháp chiết xuất
Trong phạm vi phịng thí nghiệm, hai phương pháp chiết được lựa chọn để khảo sát là: chiết siêu âm và chiết hồi lưu.
Chiết siêu âm: Sĩng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt – gây ra sự khuếch tán vào trong dung mơi của các chất cần chiết xuất. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, đơn giản, dễ sử dụng. Tuy nhiên, phương pháp cĩ nhược điểm là dịch chiết nhiều tạp.
Chiết nĩng: Sử dụng dung mơi để chiết nĩng các hoạt chất t dược liệu đã nghiền nhỏ trong bình cầu bằng phương pháp đun hồi lưu. Ưu điểm là hiệu suất chiết cao, dịch chiết thu được ít tạp chất hơn so với phương pháp chiết siêu âm, tuy nhiên hệ thống chiết phức tạp hơn.
2.3.4.3. Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến độ tan của một chất, vì vậy nhiệt độ chiết ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hịa tan chất định phân trong dung mơi chiết. Đối với chiết hồi lưu, nhiệt độ chiết thường được chọn là nhiệt độ sơi của dung mơi dùng để chiết xuất. Đối với chiết siêu âm, các bể chiết siêu âm hiện nay thường cĩ khoảng nhiệt độ làm việc t 300C đến 500C, vì vậy, lựa chọn khoảng 300C-500C để tiến hành khảo sát trong điều kiện cố định như sau:
+ Hệ dung mơi chiết: EtOH/H2O (70/30) + Thời gian chiết: 30 phút
+ Khối lượng dược liệu: 1 g + Thể tích dung mơi: 50 ml
Mỗi khảo sát được làm lặp lại 3 lần.
2.3.4.4.Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết / khối lượng dược liệu
Tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/khối lượng dược liệu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết xuất hoạt chất ra khỏi nền mẫu dược liệu. Nếu sử dụng lượng thể tích dung mơi chiết ít, một phần lớn dung mơi bị ngấm vào dược liệu, dịch chiết thu được ít dẫn đến hiệu suất chiết thấp. Ngược lại, nếu sử dụng lượng thể tích dung mơi chiết lớn, cĩ thể chiết kiệt lượng chất định phân cĩ trong mẫu thử, nhưng cũng cĩ thể dẫn tới xuất hiện nhiều tạp chất gây cản trở quá trình phân tích và phát hiện chất. Hơn nữa, việc sử dụng thể tích dung mơi chiết lớn gây tốn kém về mặt kinh tế. Chính vì vậy, việc khảo sát lựa chọn tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/dược liệu tối ưu là cần thiết. Các tỉ lệ dung mơi (ml) – dược liệu (g) được lựa chọn khảo sát trong phương pháp chiết bao gồm: 30:1, 50:1, 70:1 và 90:1.
2.3.4.5. Khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết cũng cĩ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Nếu thời gian chiết dài gây tốn kém về mặt kinh tế, đồng thời cĩ thể dẫn tới việc xuất hiện các tín hiệu tạp chất. Thời gian chiết được khảo sát như sau:
+ Hệ dung mơi chiết: EtOH/H2O (70/30) + Khối lượng dược liệu: 1 g
+ Thể tích dung mơi: 50 ml + Nhiệt độ chiết 70oC
+ Khảo sát thời gian chiết trong 1h, 2h, 3h, 4h và 5h.
2.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy chấp nhận được.
Cách khảo sát: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu đối chiếu RO1 cĩ nồng độ 1 mg/ml vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký.
Yêu cầu: số đĩa lý thuyết 2000, giá trị RSD của thời gian lưu 1% và của diện tích pic phải 2% (với phép thử định lượng). Trường hợp RSD 2% phải cĩ sự giải thích phù hợp. Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS 1,5).
2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu
Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi cĩ mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hố, tạp chất… Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã tìm được trên mẫu thử lá
R. officinalis ở Hưng yên và mẫu đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 cĩ nồng độ 1 mg/ml. Ghi lại sắc ký đồ (SKĐ).
2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Pha một dãy các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ chính xác, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, lấy kết quả về diện tích pic và dựng đường chuẩn để thu được phương trình hồi quy. Yêu cầu phương trình hồi quy cĩ R> 0,99.
Đánh giá phương trình hồi quy: xây dựng các phương trình đường chuẩn trên phần mềm minitab 19. Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher.
T phương trình đường chuẩn xây dựng được, với độ lệch chuẩn SD thu được trên bảng phân tích ANOVA, tính tốn được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của đường chuẩn (CDL và CQL) theo các cơng thức tính như sau:
CDL = 3.SD/b → CDQ = 3,3 x CDL
Trong đĩ: SD là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn; b là độ dốc của đường chuẩn.
2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp
Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được t nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mơ tả.
Khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ưu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lưu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Dung dịch khảo sát là một mẫu cĩ nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn đã xây dựng, được bơm vào hệ 6 lần sau đĩ lấy diện tích pic và thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng được khảo sát và đánh giá. Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu được cân khối lượng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý được bơm 3 lần để thu được kết quả trung bình. Các giá trị trung bình đĩ được sử dụng để đánh giá độ