Để quan sát được các P-glycoprotein, cách tốt nhất là cần đánh dấu chúng với phân tử protein phát quang xanh lá (green fluorescent protein-GFP). Dưới kính hiển vi huỳnh quang dễ dàng quan sát và hiện ảnh được các phân tử PGP nhờ sự phát huỳnh quang của GFP. Chính vì lý do đó, chúng tôi cần tổng hợp các protein này. Số lượng tế bào được tính toán cẩn thận trong một thể tích đĩa nuôi cấy. Sau làm thử nghiệm và hiệu chỉnh tối ưu, trong 1ml chứa 5000 tế bào/cm2 được chọn để làm thí nghiệm tổng hợp. Để tổng hợp protein trong màng tế bào, sodium butyrate (BS- Na(C3H7COO)) được bổ sung. Đó là muối natri của axit butyric. Nó có tác dụng khác nhau đối với tế bào động vật có vú trong nuôi cấy, bao gồm sự ức chế sinh sôi nảy nở, cảm ứng sự khác biệt và cảm ứng hoặc ức chế biểu hiện gen. Để có chất lượng tốt trong tổng hợp protein cần tối ưu hóa lượng BS được sử dụng.Trong thí nghiệm này, tôi đã khảo sát hai thông số quan trọng là thời gian kích thích(thời gian tính từ lúc thêm BS vào tế bào đến khi quan sát chúng dưới kính hiển vi) và nồng độ BS. Các nồng độ BS được thêm vào lượng tế bào trên lần lượt là 0.1 mM, 0.5 mM, 1mM và 2 mM tương ứng với các thời gian kích thích lần lượt cho từng nồng độ 1h, 12h, 18h, và 23h40 (bảng 2.1). Sau các khoảng thời gian. Các đĩa tế bào sau khi được tổng hợp với các thời gian trên đều được quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang để kiểm tra hình thái màng và sự phát huỳnh quang của nó. Tuy nhiên, để có thể quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang thì môi trường tế bào được thay bằng môi trường không phát quang. Đây là môi trường gồm 94%DMEMgfp-2 (20mg/l), 6% SVF và 0,5 ml (10mM) hepes trong điều kiện vô trùng.
Bảng 2.1: Thời gian kích thích và nồng độ BS dung trong tổng hợp protein
Thời gian 1h 12h 18h 23h40
BS (mM)
Các kết quả về hiện ảnh dưới kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi huỳnh quang và cường độ phát quang của tế bào sẽ được thảo luận chi tiết trong chương 3.