Tế bào thứ nhất được lựa chọn nghiên cứu được chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (hình 3.7a). Một video gồm 100 ảnh được ghi lại dưới camera EM-CCD nhanh và nhạy, từ đó cho phép quan sát và theo dõi dễ dàng các protein màng và trong nội bào. Các quan sát và phân tích cho thấy rằng, trong màng tế bào đồng thời tồn tại cả đơn phân tử duy nhất PGP-GFP và nhóm các phân tử PGP-GFP.
Hình 3.7 cho thấy kết quả của một đơn phân tử PGP-GFP trong màng plasma. Tín hiệu phát quang của phân tử bị dập tắt sau khoảng 1 giây. Từ hình c ta thấy tín hiệu quan sát được có sự “nhấp nháy” trong khoảng thời gian 1 giây này, sau đó bị dập tắt hoàn toàn. Hình 3.7b cho thấy quãng đường dịch chuyển tối đa tương ứng khoảng 0,72μm. Bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử có thể tính toán được bình phương dịch chuyển trung bình từ thực nghiệm (〈𝑟2(𝑡)〉 = 〈𝑥2(𝑡)〉 + 〈𝑦2(𝑡)〉) như đã trình bày ở trên và kết hợp với làm khớp số liệu từ (〈𝑟2(𝑡)〉 = 4𝐷𝜏), ta dễ dàng tính được hệ số khuếch tán dịch chuyển D. Từ hình 3.8 cho thấy MSD của đơn phân tử
Hình 3. 7. Theo dõi và phân tích một phân tử PGP-GFP (a). Quỹ đạo dịch
chuyển (x(t), y(t)) trong thời gian 1 giây (b) và cường độ tương ứng trong
này gồm 2 phân đoạn ứng với các giá trị hệ số khuếch tán bằng 𝐷1 = 0,04 ±
0,00354 𝜇𝑚2/𝑠và𝐷2 = 0,55 ± 0,238 𝜇𝑚2/𝑠. Chúng ta nhận xét rằng, có sự chuyển
tiếp từ sự khuếch tán chậm đến khuếch tán nhanh (từ D1đến D2). Điều này có nghĩa là, tế bào có các phân tử GFP hiện ảnh ở mức thấp và phân tử được theo dõi đã bộc lộ tính chất không đồng nhất của môi trường tế bào- từ môi trường có hệ số nhớt cao đến môi trường có hệ số nhớt thấp hơn. Hay tính không đồng nhất này một lần nữa cho bằng chứng về sự chuyển động của các phân tử từ môi trường bị giam giữ mạnh sang môi trường “tự do” hơn trong màng tế bào. Các kết quả này phù hợp với một số đã công bố trước đây [16].
Hình 3.8 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của đơn phân tử PGP- GFPtheo thời gian. Sử dụng phương trình (2.2 ở chương 2) để làm khớp số liệu thực nghiệm, ta thấy MSD gồm 2 phân đoạn tương ứng với các giá trị hệ số khuếch tán
D1 = 0.04 ± 0.00354 μm2/svà D2 = 0.55 ± 0.238 μm2/s.
Đối với nhóm phân tử PGP-GFP, tính chất không đồng nhất của môi trường khuếch tán cũng cho kết quả tương tự. Kết quả thể hiện trong hình 3.9.Các giá trị hệ số khuếch tán tương ứng bằng D1 = 0,057 ± 0,00628 μm2/svàD2 = 0,495 ± 0,0934 μm2/s.
Trong tế bào này, 42phân tử PGP-GFP được phân tích, tính toán các MSD và từ đó tính được hệ số khuếch ta D cho từng phân tử. Hình 3.10 biểu diễn biểu đồ kết quả phân tích thống kê hệ số khuếch tán của các phân tử protein một cùng tế bào MDCK II này. Dựa vào cường độ phát quang của các phân tử, ta thấy rõ ràng có hai phân bố vùng hệ số khuếch tán tương ứng với hai loại phân tử: một đơn phân tử duy nhất PGP-GFP và nhóm phân tử PGP-GFP. Hai phân bố này cho các kết quả trung bình về hệ số khuếch tán tương ứng: 〈D(đơn)〉 = 0,23 μm2/svà〈D(nhóm)〉 = 0,15 μm2/s. Nhận xét rằng, hệ số khuếch tán trung bình của 42 phân tử đối với các đơn phân tử duy nhất (〈D(đơn)〉 lớn hơn các nhóm phân tử 〈D(nhóm)〉. Điều này có nghĩa là tính chất động học của đơn phân tử PGP-GFP lớn hơn của nhóm phân tử. Hay nói cách khác là các đơn phân tử “linh động” hơn nhóm phân tử.Điều này sẽ
Hình 3. 8. Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của đơn phân tử PGP-GFP
được thấy trong trường hợp tính toán vận tốc dịch chuyển của phân tử. Trong trường hợp này đơn phân tử duy nhất không phải là phân tử GFP duy nhất mà chúng được đánh dấu trên bề mặt của PGP, vì hệ số khuếch tán của đơn phân tử duy nhất GFP thường có giá trị vài μm2/s[17].