Từ các bước đã thực hiện ở trên, chúng ta có một cơ sở dữ liệu để phân tích và tính toán các đại lượng cần thiết.Từ đó tính được bình phương trung bình dịch chuyển từ số liệu thực nghiệm trong không gian 2 chiều ( 2 2 2
( ) ( ) ( )
r t = x t + y t ) theo tất cả các Frame nhờ vào phần mềm matlab (chương trình code được trình bày
trong phần phụ lục).Trong đề tài này, tôi đã thực hiện đo đạc và phân tích thống kê trên một số tế bào và mỗi tế bào phân tích hàng chục phân tử riêng lẻ. Sau đó kết hợp với lý thuyết (phương trình 1.14) để xác định hệ số khuếch tán của từng phân tử PGP.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong chương này sẽ trình bày về kết quả tính toán các thông số động học như: hệ số khuếch tán, vận tốc dịch chuyển, quãng đường dịch chuyển và cường độ phát quang của đơn hạt protein. Trước tiên, các kết quả về điều kiện tối ưu để tổng hợp protein và hình thái về màng tế bào được thảo luận.
3.1. Kết quả về tổng hợp protein trong màng tế bào
Như chương 2 đã trình bày, các tế bào MDCKII được nuôi cấy và tổng hợp protein PGP-GFP (GFP đánh dấu trên bề mặt của PGP) trong màng với các thông số thay đổi là thời gian kích thích và nồng độ BS ( bảng 2.1) đã được khảo sát dưới kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang. Đây là các quan sát sơ bộ để đánh giá cường độ phát quang phụ thuộc vào các nồng độ BS khác nhau (0,1; 0;5; 1; và 2mM) và thời gian kích thích khác nhau (1h, 12h, 18h và 23h40) như thế nào. Từ đó tìm ra các điều kiện và quy trình tối ưu cho tổng hợp protein PGP-GFP. Hình 3.1 là ảnh tế bào MDCKII dưới kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang ở các thời gian kích thích và nồng độ BS khác nhau.
Hình 3. 1. Một chuỗi các ảnh tế bào MDCKII được chụp cùng 1 vị trí (chồng nhau)
dưới kính hiển vi tương phản pha và huỳnh quang tương ứng với các thời điểm khác nhau 1h; 12h; 18h và 23h40 cho 4 nồng độ BS khác nhau: a) 0,1 mM; b) 0,5 mM; c) 1mM và d) 2mM
Từ những kết quả thể hiện trên hình ảnh này, chúng ta có thể dễ dàng tính toán cường độ tương ứng được thể hiện trong hình 3.2. Trong hình này, chúng ta có thể thấy cường độ huỳnh quang của hai nồng độ sodium butyrate (BS) là 1mM và 2mM lớn hơn hơn hai nồng độ 0,1mM và 0,5mM, nhưng hầu hết các tế bào của chúng đang lan rộng. Nghĩa là chúng không khỏe mạnh. Vì vậy, tôi đã chọn nồng độ BS là 0,5 mM để nghiên cứu với thời gian kích thích là 18h (thời gian tính từ lúc thêm BS và môi trường tế bào).Sau 18h ở nồng độ này của BS, tế bào cũng có hiện tượng lan rộng.
Trong thực tế, các tế bào MDCKII cần khoảng 4h để BS xâm nhập vào màng tế bào và kích thích để tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Vì vậy, chúng tôi đã tìm thấy một quy trình tối ưu cho chuẩn bị mẫu như trong hình 3.3.
3.2. Hình thái màng tế bào MDCKII
Với các điều kiện nuôi cấy tế bào và quy trình tổng hợp protein như trên, nhìn chung các tế bào khi nghiên cứu có sức khỏe tốt. Các quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi tương phản giao thoa và kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rõ điều này.
Hình 3. 2. Cường độ huỳnh quang của các tế bào MDCKII với các nồng độ
BS (0,1mM; 0,5mM; 1mM và 2mM) tại các thời điểm khác nhau
Trong hình 3.4, chúng ta thấy rằng các tế bào khỏe mạnh bình thường và chúng bám dính tốt trên bề mặt đĩa thủy tinh (hình c và d). Trong ảnh tương phản pha (hình c), các đối tượng trong suốt (các tế bào và vi sinh vật,..) tạo ra sự thay đổi pha trong điện trường (trong xấp xỉ đầu tiên và không hấp thụ). Ở các ảnh này, chúng ta thấy rõ đường bao của tế bào, tuy nhiên cấu trúc bên trong ít được bộc lộ. Các chi tiết về hình thái màng tế bào được hiển thị rõ nét hơn trong ảnh tương phản giao thoa (hình 3.4b). Đây là một phương pháp để phát hiện các gradient pha để chuyển đổi chúng thành các biến thể cường độ. Do đó chúng ta có thể quan sát hình thái tế bào chi tiết hơn. Sự phát quang của tế bào còn thể hiện rõ nét trong ảnh huỳnh quang ở hình 3.4a tương ứng chồng khít ảnh trong hình 3.4b. Trên cùng một kính hiển vi huỳnh quang này có thể tích hợp các chế độ quan sát ở các điều kiện khác nhau giúp cho việc quan sát tế bào được chi tiết hơn.
Hình 3. 4. Hình thái màng tế bào MDCKII. a) Ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh
quang và b) là ảnh kính hiển vi tương phản giao thoa tương ứng, c) ảnh chụp dưới kính hiển vi tương phản pha và d) là ảnh chụp dưới kính hiển vi trường sáng.
3.3. Đơn phân tử protein dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRFM)
Như trong chương 2 đã trình bày, để quan sát các protein được tổng hợp trong màng tế bào chúng tôi đã đánh dấu các phân tử PGP bằng phân tử GFP trên bề mặt và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần. Hình 3.5 là ảnh của một tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần chồng khít nhau (hai cấu hình quang học này đã trình bày trong chương 2). Chúng ta thấy rằng, ảnh TIRFM hiển thị rõ nét các phân tử protein hơn so với ảnh huỳnh quang thông thường.
Dưới kính hiển vi này các đơn phân tử protein được bộc lộ chi tiết và quan sát rõ ràng có tín hiệu/nhiễu lớn. Các đơn phân tử mà ta quan sát được là:
- Duy nhất một phân tử GFP
- Hoặc một phân tử GFP liên kết với một phân tử PGP - Hoặc một phân tử GFP liên kết với một nhóm phân tử PGP
Tuy nhiên, trường hợp tồn tại duy nhất một phân tử GFP trong màng tế bào có xác xuất cực thấp, bởi vì chúng tôi đã tính toán lượng BS vừa đủ và thời gian kích thích được hiệu chỉnh tối ưu để hầu hết các phân tử GFP được liên kết với PGP. Hơn nữa, thời gian sống phát quang của GFP cực ngắn so với thời gian tái tổ hợp GFP trong dung dịch [16].
Hình 3. 5. Hình ảnh của một tế bào chồng khít dưới kính hiển vi huỳnh quang (trái) và
TIRFM (phải). Các hạt PGP-GFP được bộc lộ chi tiết trên bề mặt của tế bào, phần phóng to bên phải cho thấy chi tiết hơn hơn về protein này.
Bên cạnh đó, các nhóm phân tử GFP cũng được quan sát. Nhóm phân tử GFP liên kết với một nhóm phân tử PGP với nguyên tắc 1-1 (tức là một phân tử GFP liên kết với 1 phân tử PGP). Để phân biệt đơn phân tử duy nhất với nhóm phân tử, chúng ta dựa vào cường độ phát quang và thời gian sống phát quang của chúng. Trên hình 3.6 là tín hiệu của một phân tử PGP-GFP duy nhất (hình a) và nhóm các phân tử PGP-GFP (hình b). Đối với một phân tử duy nhất, thời gian hiện ảnh (hay thời gian sống phát quang) thường rất ngắn (quãng 1-2 giây) và nhấp nháy sau đó bị dập tắt huỳnh quang rất nhanh. Đối với nhóm phân tử protein có cường độ phát quang mạnh hơn và thời gian sống huỳnh quang lâu hơn so với một phân tử duy nhất.
Hình 3.6. Phân biệt một phân tử duy nhất protein PGP-GFP và nhóm phân tử. a) là tín hiệu phát quang của 1 phân tử duy nhất và b) là tín hiệu một nhóm phân tử. c) và d) là giản đồ mình họa cho hai loại phân tử này tương ứng.
3.4. Các thông số động học của protein PGP-GFP
Trong đề tài đã nghiên cứu các thông số động học protein trên một số tế bào đơn lẻ MDCKII. Bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử, một tập hợp các phân tử PGP-GFP được phân tích thống kê để đánh giá quy luật phân bố của các protein này. Dưới đây, báo cáo sẽ trình bày chi tiết kết quả phân tích một số tế bào đã được lựa
Hình 3. 6. Phân biệt một phân tử duy nhất protein PGP-GFP và nhóm phân tử. a) là
tín hiệu phát quang của 1 phân tử duy nhất và b) là tín hiệu một nhóm phân tử. c) và
chọn thông qua các đại lượng: hệ số khuếch tán, quãng được dịch chuyển và vận tốc dịch chuyển.