Để xác định vị trí và theo dõi các phân tử (hay các hạt) trong một video, phần mềm mã nguồn mở ImageJ Pluginđã được sử dụng. Bằng phần mềm này dễ dàng tìm quỹ đạo chuyển động của từng phân tửtheo thời gian. Dưới đây là trình bày tóm tắt cách sử dụng plugin/Mosaic/Particles Tracker in 2D/3D trong ImageJ:
➢ Tải và mở phim trong ImageJ
Một quỹ đạo của hạt được xác định khi liên kết các điểm trong từng ảnh. Trong báo cáo này, chúng tôi xử lý video (phim) có số lượng là 100 ảnh ứng với khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,05 giây. Khoảng thời gian giữa các ảnh tiếp theo cũng sẽ tăng dần theo số lượng các ảnh: ∆tn ảnh=0,05 x (số ảnh tiếp theo). Thời gian đó, gọi là thời gian trôi của phân tử. Ký hiệu là 𝜏, đơn vị giây (s).
Mở video/Import -> Image Sequence, ... từ các tập tin.
Hình 2.5. Mở video
➢ Chọn các thông số phát hiện các hạt và xem trước (preview detected)
Hình 2.6. Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ
nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, percentile=0,1
Hình 2.7.Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội
toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, nhưng với percentile=0,1(trái) và percentile=0,4 (phải)
Bằng cách thay đổi các thông số radius, cutoff, percentile và xem trước để lựa chọn các giá trị thích hợp, từ đó cho kết quả phát hiện tối đa các đốm sáng (phân tử).
➢Xem kết quả
Sau khi hoàn thành việc theo dõi hạt, cửa sổ kết quả sẽ được hiển thị Nhấp vào Visualize all Trajectories (quan sát tất cả các qũy đạo).
Hình 2.8.Quan sát tất cả các quỹ đạo của PGP. Phần đóng khung mầu xanh được
phóng to đến hình bên phải để thấy rõ hơn các quỹ đạo dịch chuyển của PGP
Từ đây chúng ta có thể lấy ra được các thông tin chi tiết cho từng quỹ đạo. Ví dụ dưới đây là hiển thị chi tiết cho quỹ đạo 1(trajectory 1) của PGP được quan sát
Hình 2.9. Thông tin quỹ đạo xuất ra từ thuật toán của Mosaic[15]trong không gian 2
chiều
Từ bảng kết quả này cho ta những thông tin quan trọng để xác định các thông số động học cần khai thác. Trên hình 2.10, cột trajectory là chỉ các quỹ đạo tương ứng với mỗi phân tử được phát hiện. Cột Frame bao gồm các hàng số liệu đại diện cho các khung hình của quỹ đạo đó và chính là tương ứng với các ảnh trong video, nó bắt đầu từ 0-nghĩa là nếu ta chọn trục z dọc theo thứ tự các ảnh thì Frame 0 sẽ là gốc tọa độ (xem hình 2.2). Cột x và y là tọa độ phụ thuộc vào thời gian (t) tương ứng của phân tử (khung hình) tại các ảnh theo hai trục x và y trong mặt phẳng (x,y).Như vậy, ứng với mỗi vị trí (hay mỗi Frame hoặc mỗi ảnh) sẽ xác định được tọa độ x(t) và y(t) (có đơn vị là pixel) của phân tử (trên ảnh là đốm sáng), từ đó dễ dàng tính được bình phương trung bình dịch chuyển theo phương x và phương y. Hình 2.11 thể hiện các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame) cho 1 quỹ đạo của phân tử.
Hình 2.10. Các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame)cho 1
quỹ đạo của phân tử
➢Nối liên kết quỹ đạo của các phân tử
Hình 2.11.Quỹ đạo chuyển động của 1 PGP theo thời gian
Bước này sẽ thực hiện việc liên kết (hay nối) các điểm tương ứng các ảnh với khoảng cách giữa các ảnh theo thời gian (t). Từ đó, xác định được quỹ đạo chuyển động của hạt (hình 2.12).