Vì H-12 của DHA cố định nên lựa chọn làm tín hiệu để tính tỷ lệ hai đồng phân S và R- được tính theo công thức sau [41, 42]:
Trong đó:
%(S-NTD.039) là phần trăm đồng phân S
S(S- NTD.039) là diện tích tín hiệu proton H-12 đồng phân S S(R- NTD.039) là diện tích tín hiệu proton H-12 của R
Dựa theo phổ 1H-NMR ta có kết quả sau: 0,820
%( .039) 100 80,39%
0,820 0, 20
SNTD x
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Mục tiêu của đề tài
Artemisinin (1) là secquiterpen lacton được phát hiện có hoạt tính kháng kí sinh trùng sốt rét rất mạnh và đã được dùng để làm thuốc chữa bệnh sốt rét rất hiệu quả. Tuy nhiên, việc sử dụng artemisinin trong lâm sàng còn bộc lộ nhiều nhược điểm như độc với hệ thần kinh, dễ gây nhờn thuốc do có thời gian bán hủy thấp. Vì vậy người ta chuyển hóa artemisinin thành các dẫn chất mới của artemisinin như dihydroartemisinin (2), metyl eter (3) … có hoạt tính cao hơn đã được dùng trong điều trị bệnh sốt rét. Các hợp chất này có ưu điểm là tan tốt trong dầu nên có thể dùng để tiêm bắp, cả hai hợp chất này đều có hoạt tính cao hơn artemisinin nhưng lại có thời gian bán huỷ nhỏ hơn và gây độc với hệ thần kinh trung ương trong điều trị trường diễn.
Sơ đồ 3.1. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn
cacbonyl của lacton ở hai hướng không gian khác nhau. Nên việc phân tích cấu trúc và các đồng phân bất đối này rất khó khăn đòi hỏi phải có phương pháp hóa lý hiện đại. Do đó đề tài này tập trung phân tích cấu trúc và đồng phân lập thể của artemisinin rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn nhằm đưa ra phương pháp phân tích hiệu quả nhất để phân tích cấu trúc và lập thể các sản phẩm chuyển hóa artemisinin một cách hiệu quả. Trong luận văn này tập sử dụng phương pháp NMR để phân tích cấu trúc và tỷ lệ các đồng phân lập thể của các phản ứng chuyển hóa artemisinin theo sơ đồ 3.1.
3.2.Phân tích cấu trúc của DHA
DHA hay dihydroartemisinin (còn được gọi là dihydroqinghaosu, artenimol) là một loại thuốc được sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét. Nó cũng là hoạt chất được chuyển hóa trong cơ thể khi sử dụng các thuốc chống sốt rét như artesunate, artemether…[27]. Cơ chế hoạt động của artemisinin cũng như DHA liên quan đến việc phân cắt của cầu endoperoxide bằng sắt tạo thành các gốc tự do như hypervalent sắt-oxo, epoxit, andehit, và các hợp chất dicarbonyl… Nhóm các gốc tự do này làm tổn thương các đại phân tử sinh của các tế bào của ký sinh trùng sốt rét và do đó tiêu diệt các ký sinh trùng này [29].
3.2.1. Tổng hợp mẫu DHA
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp mẫu DHA
DHA được tổng hợp từ phản ứng khử hóa nhóm cacbonyl bằng các tác nhân khử chọn lọc nhóm cacbonyl. Người ta thường sử dụng NaBH4 là tác nhân khử nhóm cacbonyl của artemisinin, do đó luận văn này cũng sử dụng NaBH4 làm
tác nhân khử nhóm cacbonyl của artemisinin để tổng hợp DHA. Phản ứng được thực hiện trong dung môi MeOH ở nhiệt độ -33oC nhở sử dụng 3,5 đương lượng NaBH4 nhận được sản phẩm với hiệu suất 98%. (Sơ đồ 3.2).
3.2.2. Phân tích cấu trúc của DHA bằng phương pháp NMR
Cấu trúc của DHA được phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Quy trình chuẩn bị mẫu đo phổ NMR được tiến hành theo phương pháp của Hugo E. Gottlieb [42]và được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Hình 3.1.Phổ NMR của DHA
Trên phổ 1H-NMR của DHA xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trên phân tử. Tín hiệu singlet vùng trường thấp tạo 5,60
một proton singlet tại 5,38 ppm được quy gán cho vị trí H-12 của α-DHA; Tín hiệu cộng hường doublet của một proton tại 5,29 ppm có hằng số tương tác J = 2,5 Hz là được trưng của proton H-10β-DHA; tín hiệu của proton tại 4,74 ppm với hằng số tương tác là 9,0 Hz là đặc trưng của proton H-10 α-DHA. Ngoài các tín hiệu đặc trưng thể hiện hai đồng phân α và β-DHA như đã phân tích ở trên vùng trường cao của phổ 1H-NMR thể hiện tín hiệu của ba nhóm metyl: tín hiệu cộng hưởng 0,96 ppm với hằng số tương tác 6,5 Hz là đặc trưng của nhóm metyl H-13, tín hiệu cộng hưởng tại 0,88 ppm với hằng số tương tác 7,3 Hz là đặc trưng của nhóm metyl H-14, tín hiệu singlet tại 1,29 ppm là đặc trưng của metyl H-15. Ngoài ra trên phổ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 13 proton khác của DHA. So sánh phổ 1H-NMR của DHA và artemisinin thấy xuất hiện thêm hai proton axetal tại H-10.
Phổ 13C-NMR của DHA thể hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 15 nguyên tử cacbon có mặt trên khung cấu trúc của DHA. Các dữ liệu phổ NMR của DHA hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu đã công bố trước đây [29]. Các dữ liệu phân tích ở trên cho phép khẳng định cấu trúc của DHA là hỗn hợp của hai đồng phân α và β-DHA. Sự hình thành hai sản phẩm này là do sự tấn công của NaBH4 ở cả hai hướng re-face và si-face của nhóm cacbonyl. Dữ liệu NMR
được tóm tắt trong bảng 3.1.
Hình 3.3. Cấu trúc của hai đồng phân α và β-DHA
Bảng 3.1. Dữ liệu NMR của DHA
13C 1H C3 104.29 _ C4 36.92 2.26-2.29, m; 2.37-2.40 C5 25.34 1.86-1.87, m;1.43-1.44, m C5a’ 53.26 1.18-1.20, m C6 37.90 1.36-1.38, m C7 35.17 1.61-162, m; 0.90-0.91, m C8 23.11 1.74-1.76, m; 1.83-1.84, m C8a’ 45.09 1.41-1.43, m
C10 96.03 5.29, d, J=2.5Hz (β -DHA); 4.74, d, J=9.0 Hz (α -DHA) C12 88.09 5.60, s (β -DHA); 5.38, s (α-DHA); C12a’ 81.70 - C13 20.54 0.92, d, J=6.5Hz C14 13.54 0.88, d, J=7.3Hz C15 20.06 1.29, s OH - 401, dd J=3.8, 1.3 Hz
3.2.3. Phân tích tỷ lệ hai đồng phân α và β-DHA
Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nó không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏ hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên tử hydro trong từ trường. Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân “dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ nhỏ. Như đã phân tích ở trên sản phẩm DHA là hỗn hợp của hai đồng phân α và β-DHA. Hỗn hợp hai đồng phân này được phân tích hàm lượng dựa vào cường độ (diện tích) của các proton.
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hai đồng phân α và β-DHA
Vì H-12 của DHA là tín hiệu cố định, đặc biệt là khả năng tách rõ ràng giữa hai đồng phân α và β-DHA nên chúng tôi lựa chọn để tính tỷ lệ hai đồng phân α và β-DHA [42, 43]. Kết quả tính toán như sau:
( ) %( ) 100 ( ) ( ) S DHA DHA x S DHA S DHA Trong đó:
%(αDHA) là phần trăm đồng phân α-DHA
S(αDHA) là diện tích tín hiệu proton H-12 của α-DHA S(βDHA) là diện tích tín hiệu proton H-12 của β-DHA Dựa theo phổ 1H-NMR ta có kết quả sau:
1, 000 %( ) 100 49, 38% 1, 000 1, 025 DHA x
Như vậy đồng phân α-DHA có 100-49,38=50,62% Độ chọn lọc lập thể của phản ứng: %( ) %( ) 50, 62 49, 38 . 1, 24% %( ) %( ) 100 DHA DHA d e DHA DHA
Tóm lại, phản ứng khử hóa artemisinin bằng NaBH4 nhận được hỗn hợp hai đồng phânα và β-DHA với hàm lượng tương ứng là 50,62 và 49,38 % và độ chọn lọc lập thể rất thấp 1,24%.
3.3.Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.01
3.3.1. Tổng hợp NTD.01
Sơ đồ 3.3.Tổng hợp NTD.01 từ DHA
Như đã phân tích ở trên việc khử hóa artemisinin bằng NaBH4 nhận được hỗn hợp hai đồng phân α và β-DHA. Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu
phản ứng ete hóa của hỗn hợp hai đồng phân này nhờ phản ứng với ba đương lượng của allyl ancol trong dung môi diclometan trong sự có mặt của xúc tác axit TsOH ở nhiệt độ phòng nhận được sản một sản phẩm NTD.01với hiệu suất 40% so với nguyên liệu đầu. Phản ứng được thực hiện nhiều lần và liên tục theo giõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng, cho thấy phản ứng chỉ thu được một sản phẩm duy nhất và nguyên liệu phản ững vẫn còn 50%, điều này nhận định chỉ có một đồng phân của DHA trong hỗn hợp trên tham gia phản ứng. Điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết vì DHA là hỗn hợp của hai đồng phân, nhóm OH của DHA tham gia phản ứng ete hóa phụ thuộc nhiều vào hiệu ứng không gian của nhóm OH hay phụ thuộc vào kiểu đồng phân DHA.
3.3.2. Phân tích cấu trúc của NTD.01 bằng NMR
Thiết bị và điều kiện phân tích cấu trúc của NTD.01 được thực hiện tương tự như mục 3.2.2.
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất NTD.01xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trên khung cấu trúc.
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của chất NTD.01
Tín hiệu cộng hưởng của nhóm allyl xuất hiện tại: 5,85-5,93 ppm (1H, m) được gán cho vị trí H-2” của allyl; tín hiệu cộng hưởng multiplet tại 5,24- 5,28 ppm (1H, m) và 5,12-5,15( 1H, m) được gán cho hai proton của vị trí H- 3” của allyl; tín hiệu cộng hưởng tại 4,30-4,34 ppm (1H, m) và 3,97-4,02 (1H, m) được gán cho hai proton ở vị trí H-1” của nhánh allyl. Ngoài ra trên khung cấu trúc xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng tương tự như của DHA, giá trị cộng hưởng của proton H-12 tại 5,41 ppm tương tự như độ dịch chuyển của
proton H-12 của β-DHA, proton H-10 chuyển về trường cao hơn cộng hưởng tại 4,84 ppm (1H, d, J =3.5 Hz).
Mặt khác, trên phổ 13C-NMR của NTD.01 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 18 nguyên tử cacbon trong đó 15 tín hiệu cộng hưởng của cacbon đều phù hợp với giá trị cộng hưởng của 15 nguyên tử cacbon của β-DHA và 3 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của nhóm O-allyl. Các dữ liệu phân tích trên cho phép khẳng định cấu trúc của NTD.01.
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của chất NTD.01
3.4.Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.031
Liên kết đôi của anken là mặt phẳng do đó khi thực hiện phản ứng epoxit hóa sẽ có hai hướng tấn công là mặt re-face và mặt si-face nên khi epoxit hóa bằng tác nhân không chọn lọc thường nhận được hỗn hợp các sản phẩm epoxit (oxiran) là: S-oxiran và R-oxiran. Việc phân tích cấu trúc của các oxiran đòi hòi cần phải nắm chắc phương pháp NMR. Trong phần này chúng tôi tiến hành
phân tích cấu trúc của các oxiran được tổng hợp nhờ phản ứng epoxit hóa liên kết đôi của hợp chất allyl-DHA (NTD.01).
3.4.1. Tổng hợp chất NTD.031
Do mCPBA là tác nhân oxy hóa chọn lọc liên kết đôi nhưng không chọn lọc lập thể và thường được dùng để oxy hóa các hợp chất có chứa liên kết đôi có chứa các nhóm dễ bị oxy hóa. Hợp chất NTD.01 trên có chứa nhiếu trung tâm phản ứng nên việc lựa chọn tác nhân oxy hóa chọn lọc liên kết đôi là rất quan trọng.
Sơ đồ 3.4. Tổng hợp chất NTD.031
Hợp chất NTD.031 được tổng hợp nhờ phản ứng của NTD.01 với 3 đương lượng mCPBA trong dung môi diclometan tại nhiệt độ phòng nhận được hỗn hợp oxiran NTD.031.
3.4.2. Phân tích cấu trúc của NTD.031
Cấu trúc của NTD.031 được phân tích bằng phương pháp NMR, các điều kiện đo mẫu và thiết bị đo mẫu được thực hiện tương tự như các hợp chất đã được trình bày ở trên.
Phổ 1H-NMR thể hiện NTD.031 là hỗn hợp hai đồng phân epoxit (oxiran), phần lớn các tín hiệu của các trung tâm bất đối được tách ra khỏi nhau trong từ trường. Tín hiệu của proton H-12 và H-10 trên khung cấu trúc của hợp phần artemisinin đều được tách biệt giữa hai đồng phân
3,91 ppm (2H, m) là đặc trưng của H-3” ở mạch nhánh của S-oxiran, trong đó H- 3” của R-oxiran cộng hưởng ở vùng trường cao hơn 3,76-3,80 ppm (2H, m). Tín hiệu cộng hưởng của H-2” cũng được tách biệt trong từ trường, giá trị cộng hưởng tại 3,46-3,49 (1H, m) là H-2”của R-oxiran); 3,37-3,39 (1H, m) là H-2”của S-oxiran. Tín hiệu của H-1” cộng hưởng tại 3,67-3,74 (4H, m).
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất NTD.031
Trên phổ 13C-NMR của NTD.031 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 18 nguyên tử cacbon của hai đồng phân lập thể. So sánh với phổ 13C-NMR của hợp chất NTD.031 với NTD.01 thì các tín hiệu của nhóm olefin đã hoàn toàn mất đi đồng thời xuất hiện tín hiệu đặc trưng của vòng epoxit tại 53,8 ppm (C-2”) và 45,2 ppm (C-3”).
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất NTD.031
Kết quả phân tích các dữ liệu NMR ở trên cho phép khẳng định cấu trúc của NTD.031.
3.4.3. Phân tích tỷ lệ hai đồng phân oxiran bằng 1H-NMR
Vì H-12 của DHA cố định nên lựa chọn làm tín hiệu để tính tỷ lệ hai đồng phân S và R-oxiran (epoxit) được tính theo công thức sau [41, 42]:
( ox ) %( ox ) 100 ( ox ) ( ox ) S S iran S iran x S S iran S R iran Trong đó:
S(R-oxiran) là diện tích tín hiệu proton H-12 của R-oxiran
Hình 3.9. Tỷ lệ tích phân của H-12 và H-10
Dựa theo phổ 1H-NMR ta có kết quả sau:
0, 750
%( ox ) 100 69, 25%
0, 750 0, 333
S iran x
Như vậy đồng phân R-oxian có 100-69,25=30,75% Độ chọn lọc lập thể của phản ứng: %( ) %( ) 69, 25 30, 75 . 38, 5% %( ) %( ) 100 DHA DHA d e DHA DHA
Tóm lại, phản ứng epoxit hóa hợp chất NTD.01 nhận được hỗn hợp hai đồng phân đối quang S-oxiran và R-oxiran(NTD.031) với tỷ lệ các đồng phân lần lượt là 69,25 và 30,75%; độ chọn lọc lập thể là 38,5%.
3.5.Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.039
Vòng epoxit dẽ dàng tham gia phản ứng với các nhân mở vòng nucleophin, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu phân tích cấu trúc và tỷ lệ các đồng phân sản phẩm mở vòng epoxit NTD.031 bằng phương pháp NMR.
3.5.1. Tổng hợp NTD.039
Phản ứng mở vòng NTD.031 được thực hiện nhờ phản ứng với 1,5 đương lượng morpholin nhờ xúc tác Ni-Salen trong dung môi diclometan ở
nhiệt độ phòng trong thời gian 24h nhận được hỗn hợp sản phẩm với hiệu suất là 60%.
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp NTD.039 3.5.2. Phân tích cấu trúc của (NTD.039)bằng NMR
Cấu trúc của NTD.039 được phân tích bằng NMR trong thiết bị và điều kiện đo như đối với các mẫu đã được nghiên cứu ở trên.
Phổ 1H-NMR của hợp chất NTD.039 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trong hỗn hợp hai đồng phân sản phẩm mở vòng. Tín hiệu cộng hưởng singlet tại 5,44 ppm là đặc trưng của của proton H-12 của đồng phân R-NTD.039; tín hiệu cộng hưởng ở trường mạnh hơn 5,42 ppm là đặc trưng của H-12 của đồng phân S-NTD.039. Proton H-10 cũng được phân tách trong từ trường; giá trị cộng hưởng tại 4,82 ppm là đặc trưng của H-10
đồng phân R-NTD-039. So sánh phổ 1H-NMR của NTD.031 với NTD.039 xuất hiện thêm tín hiệu cộng hưởng của nhân morphonlin tại 3,79-3,69 (4H, m, CH2-