2.4.1. Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu xác định phenol bằng phương pháp HPLC HPLC
2.4.1.1.Khảo sát bước sóng xác định phenol
Chuẩn bị dung dịch chuẩn phenol nồng độ 100 ppm. Sử dụng detector PDA khảo sát phenol tại khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm. Các điều kiện khác cố định không đổi gồm pha động là hỗn hợp axetonitril và dung dịch đệm photphat có pH = 3 với tỉ lệ 70:30 về thể tích, nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 mL/phút. Tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch phenol từ bước sóng 200 nm đến 400 nm để xác định bước sóng tối ưu.
2.4.2.2. Khảo sát tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát tốc độ dòng ở các giá trị 0,6; 0,8; 1,0 và 1,2 mL/ phút. Các điều kiện khác cố định không đổi gồm pha động là hỗn hợp axetonitril và dung dịch đệm photphat có pH = 3, với tỉ lệ 70:30 về thể tích, nhiệt độ cột là 30oC, detector PDA với bước sóng 272 nm.
2.4.2.3. Khảo sát tỷ lệ pha động
Có thể nói sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Thành phần pha động ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký.
27
Pha động thường có hai loại, đó là pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp. Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược. Loại pha động này phù hợp với chất phân tích là chất phân cực yếu.
Qua nghiên cứu tài liệu [45], cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và nước được lựa chọn nhiều. Bên cạnh đó, một số loại dung dịch đệm (đệm phosphat, đệm acetat…) cũng là dung môi hay được sử dụng, những dung môi này đem lại hiệu quả cao, chi phí thấp. Độ phân cực của một số dung môi dùng làm pha động được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Tính chất của một số loại dung môi dùng làm pha động
Dung môi Độ phân cực Độ rửa giải Độ nhớt (250C) Chỉ số khúc xạ (250C) Nhiệt độ sôi (0C) Tetrahydrofuran 4,0 0,57 0,46 1,405 66 Methanol 5,1 0,95 0,54 1,326 65 Acetonitrile 5,8 0,65 0,34 1,341 82 Ethylenglycol 6,9 1,11 16,5 1,431 182 Nước 10,2 Lớn 0,89 1,333 100
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho phép phân tích xác định phenol bằng phương pháp HPLC.
2.4.2.4. Khảo sát tỷ lệ pha động
Khảo sát hệ dung môi pha động gồm axetonitril và dung dịch đệm photphat có pH bằng 3 với các tỉ lệ 50:50; 60:40; 70:30; 80:20 và tỉ lệ 90:10 về thể tích. Các điều kiện khác cố định không đổi, đó là tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector PDA ở bước sóng 272 nm, nhiệt độ cột 30 0C.
2.4.2. Xây dựng đường chuẩn xác định phenol bằng phương pháp HPLC
Dựa trên các điều kiện đã khảo sát được, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn xác định phenol bằng phương pháp HPLC như sau:
28
- Pha dung dịch phenol 500 mg/L bằng cách: Cân 0,25 g phenol trên cân điện tử 4 số Precisa XT 120A – Switland (Thụy Sỹ). Sau đó hòa tan sơ bộ trong nước cất hai lần, đưa vào bình định mức 500 mL, thêm nước cất hai lần tới vạch định mức rồi lắc đều.
- Pha dãy mẫu chuẩn các dung dịch phenol có nồng độ tăng dần từ 50 mg/L; 75 mg/L; 100 mg/L; 150 mg/L; 175 mg/L và 200 mg/L, bằng cách lấy một lượng nhất định dung dịch phenol 500 mg/L, pha loãng và định mức bằng nước cất hai lần trong các bình định mức có dung tích tương ứng.
Tiến hành chạy sắc ký đồ của các dung dịch phenol trong dãy mẫu chuẩn, ở cùng điều kiện về nhiệt độ phòng (250C ± 0,5), bước sóng 272 nm, pha động gồm axetonitril và dung dịch đệm photphat (pH = 3) theo tỷ lệ 70:30 (về thể tích), detector PDA thu được các giá trị diện tích pic tương ứng của phenol.
Xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic của phenol vào nồng độ, xử lý thống kê đồ thị sẽ thu được đường chuẩn.