Để xác định một cấu tử X nào đó, ta chuyển nó thành hợp chất có khả năng hấp thụ ánh sáng rồi đo sự hấp thụ ánh sáng của nó và suy ra hàm lượng chất cần xác định.
Cơ sở của phương pháp này là dựa vào định luật Lambert - Beer. Phương trình: (1.5)
Trong đó: A: độ hấp thụ ánh sáng (tỉ lệ thuận với nồng độ C);
I, I0: cường độ bức xạ điện từ trước và sau khi qua chất phân tích; : hệ số hấp thụ quang phân tử, nó phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ ánh sáng và bước sóng của ánh sáng tới (= f (λ) ).
Trong đó: l: độ dày cuvet;
C: nồng độ chất phân tích.
Như vậy, độ hấp thụ quang A là một hàm của các đại lượng: bước sóng, bề dày dung dịch và nồng độ chất hấp thụ ánh sáng: 0 lg I . . A l C I
A = f (λ,l,C) (1.6)
Do đó nếu đo A tại một bước sóng λ nhất định với cuvet có bề dày l xác định thì đường biểu diễn A = f (C) phải có dạng y = ax là một đường thẳng. Tuy nhiên, do những yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch (bước sóng của ánh sáng tới, sự pha loãng dung dịch, nồng độ H+, sự có mặt của các ion lạ) nên đồ thị không có dạng đường thẳng với mọi giá trị của nồng độ. Do vậy phương trình định luật Lambert - Beer có dạng:
A = k..l.(Cx)b (1.7)
Trong đó:
Cx: nồng độ chất phân tích; k: hằng số thực nghiệm;
b: hằng số có giá trị 0 < b < 1 (b là một hệ số gắn liền với nồng độ Cx). Đối với chất phân tích trong một dung môi xác định, trong một cuvet có bề dày xác định thì = const và l = const. Đặt K = k. .l. Ta có:
A = K.Cxb (1.8)
Phương trình này là cơ sở để định lượng các chất theo phép đo quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis. Phương pháp phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV - Vis được sử dụng rất thuận lợi và phổ biến để phân tích các chất [11].
Trong nghiên cứu này, xác định nồng độ metylen xanh trên máy UV–Vis 02 chùm tia Model: UH5300, Hitachi - Nhật Bản, 2016 tại trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên ở bước sóng = 664nm, cuvet thủy tinh 1cm.
Phương pháp đường chuẩn
Cơ sở của phương pháp: Dựa trên sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của cấu tử cần xác định trong mẫu A = K.Cxb.
Cách tiến hành:
+ Pha chế một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ hấp thụ ánh sáng nằm trong vùng nồng độ tuyến tính (b = 1).
+ Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch chuẩn.
+ Xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của cấu tử cần nghiên cứu (phụ thuộc tuyến tính) A = f (C). Đồ thị này được gọi là đường chuẩn. Đường chuẩn có dạng là đường thẳng đi qua gốc tọa độ.
+ Pha chế các dung dịch phân tích với điều kiện như xây dựng đường chuẩn và đem đo độ hấp thụ quang A với điều kiện như xây dựng đường chuẩn (cùng dung dịch so sánh, cùng cuvet, cùng bước sóng). Dựa vào các giá trị độ hấp thụ quang A này và đường chuẩn tìm được nồng độ Cx tương ứng [16].
Nồng độ MB trong nghiên cứu này được xác định bằng phương pháp UV -Vis trên máy Hitachi UH - 5300 tại bước sóng 526 nm tại Trường Đại học Y - Dược, Đại học Thái Nguyên.