Kỹ thuật cấy đếm là kỹ thuật nuôi cấy nhằm xác định số lượng vi khuẩn có khả năng phát triển từ bệnh phẩm hoặc trong một huyền dịch vi khuẩn.
Dựa trên kỹ thuật cấy đếm để đánh giá tác động của hạt nano vàng khi có hiệu ứng quang nhiệt lên tế bào vi khuẩn. Huyền dịch vi khuẩn chuẩn bị như trên độ đục chuẩn McFarland 0,5. Pha loãng bậc mười từ huyền dịch ban đầu. Huyền dịch vi khuẩn ở các nồng độ được thêm vào các dung dịch có sẵn dung dịch nano vàng, PHMB và hỗn hợp 2 dung dịch, trộn đều bằng pipet. Với các mẫu có chứa hạt nano vàng, tiến hành chiếu laze có bước sóng 532 ± 10 nm trong 7 phút. Dùng que cấy (thủy tinh) đã tiệt trùng, cắm que cấy thẳng đứng, chỉ nhúng đầu que cấy xuống canh khuẩn, rồi ria một đường thẳng khoảng 1,2 cm lên đĩa thạch. Thay que cấy và tiếp tục ria với các mẫu khác. Sau đó, đặt úp đĩa thạch cho vào tủ ấm 37oC, nuôi qua đêm.
Bảng 2.3. Các dung dịch thử nghiệm cấy đếm
Kiểm chứng Au PHMB PHMB + Au Vi khuẩn 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl H2O 180 µl 20 µl 160 µl PHMB 0.05% 20 µl 20 µl Au 160 µl 160 µl 2.8. Kết luận
Trong chương này, đề tài đã mô tả các vật liệu, hóa chất, quy trình điều chế nano vàng cũng như thử nghiệm khả năng kháng/diệt khuẩn trên cơ sở hiệu ứng quang nhiệt. Các thiết bị hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao. Phép phân tích được chuẩn hóa của các phòng thí nghiệm hàng đầu ở Việt Nam.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phổ hấp thụ UV-vis
Dung dịch nano vàng đã được chế tạo thành công bằng phương pháp điện hóa từ vàng kim loại dạng khối. Trong nghiên cứu này, nano vàng sau chế tiếp tục được khảo sát khả năng phát triển hạt bằng cách xử lý vi sóng ở các điều kiện khác nhau. Hình 3.1 là ảnh của dung dịch vàng sau khi chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lý vi sóng. Quan sát bằng mắt thường thấy rằng tất cả các mẫu đều có màu đỏ tươi đặc trưng của nano vàng. Như vậy, có thể xác định sơ bộ rằng đã có sự hình thành nano vàng trong dung dịch sau điện hóa, màu sắc dung dịch không thay đổi dưới tác động của vi sóng. Một số nghiên cứu cho thấy rằng màu sắc của dung dịch nano vàng thay đổi khi kích thước hạt thay đổi [7][24]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, màu sắc dung dịch nano vàng thu được sau điện hóa và kết hợp xử lý vi sóng đều không nhận thấy sự thay đổi nào. Do vậy có thể giả định rằng nano vàng đã được hình thành trong quá trình điện hóa và chúng không bị ảnh hưởng bởi việc xử lý vi sóng, thậm chí tới 15 phút.
Hình 3.1. Dung dịch nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp
xử lý vi sóng theo thời gian khác nhau
Để có bằng chứng khoa học hơn, phổ hấp thụ UV-vis đã được thực hiện đối với các mẫu. Hình 3.2 cho thấy phổ hấp thụ UV-vis của các dung dịch
nano vàng sau điện hóa và điện hóa kết hợp xử lý vi sóng theo thời gian khác nhau. Đường màu đen là phổ hấp thụ của mẫu điện hóa không xử lý vi sóng, các đường màu đỏ, xanh, hồng, nâu và tím lần lượt là các mẫu điện hóa kết hợp xử lý vi sóng 1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút, và 15 phút. Từ phổ hấp thụ UV-vis thấy rằng tất cả các dung dịch đều có đỉnh hấp thụ tại 538 nm đây được cho là đỉnh hấp thụ của hạt nano vàng. Ngoài ra các mẫu kết hợp vi sóng có cường độ hấp thụ lớn hơn so với mẫu không vi sóng khi đo đạc cùng nguồn mẫu và cùng điều kiện đo. Điều này chứng tỏ dưới tác dụng của vi sóng khả năng hấp thụ của các hạt nano vàng được tăng cường.
Hình 3.2. Phổ UV-vis của nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lí vi sóng với thời gian khác nhau
3.2. Hình ảnh TEM
Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cũng được sử dụng để kiểm tra hình dạng và sự đồng đều của hạt nano vàng trong dung dịch theo các điều kiện xử lý vi sóng khác nhau. Tuy nhiên, thực tế quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chúng tôi không nhận thấy sự khác biệt kể cả về hình thái và kích thước. Những hình ảnh quan sát trên vi trường đều cho thấy phần lớn các hạt là hình cầu, nhưng cũng có những hạt hình dạng khác như tam giác, tứ
giác xen kẽ, tất cả những hạt này đều có kích thước trong dải 20 - 30 nm. Hình 3.3a cho thấy hình ảnh của mẫu điện hóa không vi sóng. Hình 3.3b, c, d, e và f đều là hình ảnh hạt nano vàng của tương ứng với các mẫu kết hợp xử lý vi sóng 1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút và 15 phút.
Hình 3.3. Ảnh TEM của các mẫu nano vàng xử lý bằng vi sóng theo thời gian khác nhau: (a) không vi sóng; (b) 1 phút; (c) 3 phút; (d) 5 phút; (e) 10 phút;
3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)
Hình 3.4. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa
Cấu trúc tinh thể của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa được khảo sát bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Hình 3.4 là giản đồ nhiễu xạ tia X của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa từ hai điện cực vàng khối trong 3 giờ. Từ phổ XRD thấy rằng xuất hiện các đỉnh nhiễu xạ của các họ mặt tinh thể (111); (200); (220) và (311) tương ứng với các vị trí góc nhiễu xạ 2 là 37,38o; 43,52o; 63,94o và 77,22o đặc trưng của tinh thể vàng cấu trúc lập phương tâm mặt (JCPDS no. 00-004-0784). Các đỉnh nhiễu xạ có cường độ lớn sắc nét chứng tỏ các hạt nano vàng thu được sau điện hóa kết tinh rất tốt. Ngoài các đỉnh nhiễu xạ của pha tinh thể vàng nói trên không xuất hiện đỉnh nhiễu xạ nào khác. Điều này chứng tỏ, các hạt nano vàng thu được là đơn pha tinh thể lập phương tâm mặt của vàng.
Tính toán theo phương trình Scherrer cho đỉnh nhiễu xạ có cường độ cao nhất (111) tại góc nhiễu xạ 2 là 37,38o thu được bán kính tinh thể trung bình của các hạt nano vàng là 30nm.
3.4. Phân tích thành phần bằng EDX
Hình 3.5. Phổ EDX của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa
Thành phần nguyên tố trong dung dịch nano vàng được khảo sát thông qua phương pháp đo phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) gắn trên kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình 3.5. là phổ EDX của hạt nano vàng sau quá trình điện hóa. Kết quả cho thấy xuất hiện các đỉnh ứng với các nguyên tố Au và các nguyên tố Na, C, O là thành phần của muối natri citrat. Điều này chứng tỏ dung dịch tạo thành sau điện hóa có độ sạch cao chỉ gồm có vàng và natri citrat. Thành phần (%) theo khối lượng và theo số nguyên tử của các nguyên tố được thống kê ở Bảng 3.1. Ở đây ta thấy tỷ lệ % theo khối lượng của Au là 74,37% và theo số nguyên tử là 17,09 so với natri lần lượt là 3,02 và 5,95 như vậy nồng độ của nano vàng lớn hơn rất nhiều so với natri citrate. Có thể nói phương pháp chế tạo nano vàng bằng phương pháp điện hóa tạo ra dung dịch nano vàng sạch thành phần nano vàng chiếm chủ yếu.
Bảng 3.1. Thành phần % các nguyên tố trong mẫu nano vàng chế tạo bằng
phương pháp điện hóa
Nguyên tố % khối lượng % nguyên tử
C 13,88 52,26
O 8,73 24,70
Na 3,02 5,95
Au 74,37 17,09
3.5. Kết quả thế Zeta
Kiểm tra độ ổn định và khả năng phân tán của hạt nano vàng thu được bằng phương pháp điện hóa và điện hóa kết hợp xử lý vi sóng. Kết quả đo thế bề mặt (thế Zeta) của các mẫu chế tạo ở điều kiện khác nhau được thống kê ở Bảng 3.2. Hình 3.6a cho thấy giản đồ thế zeta của dung dịch nano vàng sau điện hóa không xử lý bằng vi sóng, có đỉnh thế tại -26,9 mV. Hình 3.6b, 3.6c, 3.6d là giản đồ thế bề mặt của mẫu sau điện hóa kết hợp xử lý vi sóng trong 1 phút, 3 phút và 5 phút có đỉnh thế lần lượt là -26,2 mV, - 28,5 mV, -27,8 mV. Cả 4 mẫu này thế bề mặt có giá trị chênh lệch không đáng kể chứng tỏ sự ổn định của các dung dịch khá đồng đều. So sánh sự ổn định của hạt trong dung dịch với đỉnh thế zeta, các đỉnh đều gần với -30 mV ở mức ổn định trung bình [25]. Như vậy, với các dung dịch nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa và phương pháp điện hóa kết hợp xử lý vi sóng 1 phút, 3 phút và 5 phút có độ ổn định ở mức trung bình, vẫn có khả năng bị kết tụ. Do vậy, việc bảo quản lâu dài của nano vàng nên để ở nhiệt độ mát hoặc 4 - 8oC. Tuy nhiên, các mẫu này chỉ có 1 đỉnh thế duy nhất với cường độ lớn độ rộng hẹp chứng tỏ các hạt nano vàng rất đồng đều, hoàn toàn phù hợp với sự quan sát sơ bộ từ ảnh TEM. Hình 3.6e giản đồ thế Zeta của mẫu xử lí vi sóng trong 10 phút có hai đỉnh thế tại giá trị - 34,9 mV và -61,4 mV. Mẫu này xuất hiện hai đỉnh thế bề mặt điều này chứng tỏ các hạt nano vàng phân tán trong dung dịch có dải
phân bố kích thước rộng cụ thể ở đây có hai dải kích thước ứng với hai đỉnh thế. Hình 3.6f là mẫu xử lý vi sóng trong 15 phút có đỉnh thế zeta tại giá trị - 41,4 mV đã chứng tỏ mẫu tương đối ổn định. Hai mẫu xử lý vi sóng 10 phút và 15 phút đều có đỉnh thế Zeta nhỏ hơn giá trị -30 mV. Như vậy, các mẫu xử lý vi sóng trong thời gian 10 và 15 phút có độ ổn định cao. Ngoài ra, đỉnh thế có giá trị âm chứng tỏ lớp điện tích bề mặt của nano vàng là điện tích điện âm. Đặc biệt, để có thể thu được nano vàng với những kích thước khác nhau, chúng tôi đã tiến hành ly tâm phân đoạn của mẫu sau xử lý vi sóng trong 10 phút.
(a)
(b)
(e) (f)
Hình 3.6. Giản đồ thế Zeta của các mẫu xử lý vi sóng theo thời gian khác
nhau: (a) không vi sóng; (b) 1 phút; (c) 3 phút; (d) 5 phút; (e) 10 phút; (f) 15 phút
Kết hợp với kết quả EDX, có thể đảm bảo các hạt nano vàng trong dung dịch được bao bọc bởi các ion âm gốc citrat bám trên bề mặt [26]. Trong thí nghiệm này natri citrat vừa đóng vai trò là dung dịch chất điện phân vừa là chất hoạt động bề mặt [27], hình thành lên lớp tích điện âm góp phần chống lại sự kết tụ của các hạt nano Au tạo thành, duy trì sự ổn định của các hạt trong dung dịch.
Bảng 3.2. Đỉnh thế Zeta của các mẫu chế tạo ở điều kiện khác nhau
Tên mẫu Đỉnh thế Zeta (mV)
Không xử lý vi sóng -26,9 Vi sóng 1 phút -26,2 Vi sóng 3 phút -28,5 Vi sóng 5 phút -27,8 Vi sóng 10 phút -34,9 và -61,4 Vi sóng 15 phút -41,4
3.6. Nano vàng từ ty tâm phân đoạn
Qua kiểm tra bước sóng hấp thụ ứng với tần số plasmon bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV-vis thấy rằng các mẫu đều cho đỉnh hấp thụ tại 538
nm. Ngoài ra quan sát ảnh TEM của các mẫu thấy rằng mặc dù sau điện hóa được xử lý vi sóng với thời gian khác nhau nhưng vẫn chỉ thu được các hạt nano vàng dạng cầu. Như vậy có thể nói các hạt nano vàng sau điện hóa là ổn định. Tuy nhiên khi phân tích thế zeta thấy rằng với mẫu 10 phút vi sóng có hai dải phân bố kích thước và mẫu 15 phút độ rộng đỉnh thế mở rộng điều này chứng tỏ với hai mẫu này dải kích thước được mở rộng. Trong đề tài này, để thu được các hạt nano vàng có hai dải kích thước khác nhau tôi đã chọn phương pháp ly tâm phân đoạn dung dịch nano vàng xử lý vi sóng 10 phút. Dung dịch nano vàng được ly tâm ở hai tốc độ 5.000 vòng/ phút và 15.000 vòng/phút, thu phần dịch lắng. Hình 3.7 là phổ UV-vis của hai dung dịch nano vàng ly tâm ở 5000 vòng/phút và 15.000 vòng/phút. Từ phổ UV-vis thấy rằng đỉnh hấp thụ plasmon của mẫu 5.000 vòng trên phút tại bước sóng 538 nm, đối với mẫu ly tâm 15.000 vòng/phút đỉnh hấp thụ tại bước sóng 531 nm. Có sự thay đổi bước sóng cực đại hấp thụ giảm từ 538 nm xuống 531 nm điều này chứng tỏ quay li tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút ta thu được các hạt có kích thước nhỏ hơn 5.000 vòng/phút [7].
Hình 3.7. Phổ UV-vis của mẫu nano vàng sau xử lý vi sóng 10 phút được ly
Hình 3.8. Ảnh TEM các hạt nano vàng sau xử lý vi sóng 10 phút được ly tâm phân đoạn với tốc độ 5000 vòng/phút (a) và 15.000 vòng/phút (b)
Có thể kiểm tra sự phân bố kích thước hạt một cách trực quan hơn thông qua phương pháp chụp ảnh hiển vi truyền qua TEM. Hình 3.8 là ảnh TEM của các mẫu nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lý vi sóng trong 10 phút được ly tâm ở tốc độ khác nhau. Hình 3.8a là mẫu ly
tâm ở 5000 vòng/phút và Hình 3.8b là mẫu ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút. Với mẫu ly tâm 5000 vòng/phút thu được các hạt có đường kính trong khoảng 38,8 nm đến 42,3 nm, với mẫu ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút thu được các hạt có đường kính từ 11 nm đến 15,2 nm. Như vậy bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ khác nhau thì có thể thu được các hạt nano vàng có dải kích thước khác nhau.
3.7. Hiệu ứng quang nhiệt của nano vàng
Các mẫu nano vàng ly tâm phân đoạn ở tốc độ khác nhau được đánh giá hiệu ứng quang nhiệt theo phương pháp kích thích bằng nguồn laze có bước sóng =532nm trong 20 phút.
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn độ biến thiên nhiệt độ theo thời gian chiếu laze của nước và các dung dịch nano vàng ly tâm phân đoạn ở tốc độ khác nhau
khi được chiếu sáng bởi nguồn laze có bước sóng 532 nm
Hình 3.9. là biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của nhiệt độ dung dịch nano vàng theo thời gian chiếu laze. Đường màu xanh nước biển là mẫu đối chứng nước cất hai lần, đường màu xanh lá cây là mẫu ly tâm phân đoạn ở 5.000 vòng/phút, đường màu đỏ là mẫu ly tâm ở 15.000 vòng/phút. Kết quả
cho thấy rằng dưới tác dụng của laze nhiệt độ nước cất chỉ tăng từ 0,4oC cho đến 1,8oC sau 20 phút trong khi đó đối với mẫu ly tâm ở 5000 vòng/phút nhiệt độ tăng 1,6oC sau 1 phút và đạt giá trị 4,9oC sau 20 phút. Đối với mẫu ly tâm ở 15.000 vòng/phút sau thời gian 1 phút nhiệt độ tăng thêm là 2,2oC và giá trị nhiệt độ tăng thêm sau 20 phút là 5,2oC. Kết quả trên chứng tỏ đã xảy ra hiệu ứng quang nhiệt với các dung dịch nano vàng khi được chiếu sáng bằng laze có bước sóng 532 nm, hệ nano vàng có kích thước nhỏ hơn có xu hướng tăng nhiệt cao hơn. Một số nghiên cứu khác đã công bố cũng cho thấy nano vàng có thể tăng từ 3 - 6oC khi chiếu laze với bước sóng 532 nm [23]. Trong nghiên cứu này, nhiệt độ cũng đã gần tương đương với những nghiên cứu đã công bố. Sự thấp hơn có thể do trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi đã không có được thiết bị đo nhiệt độ liên tục với đầu đo cho thể tích dung dịch nhỏ.
Mặc dù vậy, nghiên cứu này cũng đã cho thấy tiềm năng sử dụng hiệu ứng quang nhiệt ứng dụng trong y sinh học, đặc biệt là trong việc hỗ trợ nhả