Nguyên tắc đo: Mạng tinh thể được tạo thành bởi các nguyên tử hoặc ion ở các nút mạng. Mỗi vật liệu có một cấu trúc tinh thể khác nhau. Khi chiếu chùm tia X vào vật liệu. Sự sắp xếp của các nguyên tử trong mạng tinh thểkhác nhau cũng dẫn đến sự nhiễu xạ của tia X khác nhau. Do vậy, từ nhiễu xạ tia X cũng có thể xác định được các tính chất của mạng tinh thể như: kích thước, hình dạng của ô đơn vị, sự sắp xếp của nguyên tử trong ô đơn vị và loại hệ tinh thể. Ưu điểm của phương pháp nhiễu xạ tia X là cho phép xác định cấu trúc tinh thể một cách nhanh chóng chỉ cần một lượng nhỏ mẫu và mẫu không bị phá hủy. Khoảng cách d giữa các mặt tinh thể được xác định theo công thức khi thỏa mãn điềukiện phản xạ Bragg:
2dsin = n.
Trong đó là nhiễu phản xạ, là bước sóng tia X, n là bậc nhiễu xạ, d làhằng số mạng.
Thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X kích thước tinh thể trung bình có thể được tính theo phương trình Scherrer:
cos ) 2 ( 9 , 0 = D
Dkích thước tinh thể trung bình; bước sóng tia X; bán độ rộng; góc nhiễu xạ.
Chuẩn bị mẫu đo: Sử dụng mẫu bột nano vàng. Dể thu bột hạt nano vàng, dung dịch nano vàng sau điện hóa được đưa vào máy quay li tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút, trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo, nhỏ nhiều lớp dung dịch nano vàng lên lam kính tạo thành màng dày. Sau đó, để khô trong không khí và phân tích nhiễu xạ tia X. Phép đo được thực hiện trên máy đo nhiễu xạ tia X - D2 tại Phòng thí nghiệm thực hành trường Đại học Khoa học Thái Nguyên.
Hình 2.14. Máy nhiễu xạ tia X- D2 tại Phòng thí nghiệm thực hành - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên
2.4.5. Phương pháp đo thế Zeta
Trong nghiên cứu này, thế Zeta được sử dụng để xác định sự ổn định của dung dịch nano vàng sau khi chế tạo. Thế zeta (ξ) là đại lượng đặc trưng cho sự ổn định của hệ phân tán các hạt rắn trong chất lỏng (còn gọi là hệ keo). Các hạt với diện tích bề mặt nhất định sẽ hấp thụ những ion có điện tích trái dấu từ trong dung dịch để tạo thành một lớp điện tích bao quanh hạt. Những ion trên lớp điện tích này lại hấp thụ các ion trái dấu với chúng trong dung hình thành nên một lớp điện tích kép: lớp trong (lớp Sterm) gồm các ion liên kết mạnh với bề mặt hạt và lớp ngoài (lớp khuếch tán) liên kết yếu hơn với bề mặt hạt.
Thế zeta được đo bằng cách áp đặt một điện trường qua hệ phân tán, dưới tác dụng của điện trường, các hạt trong hệ sẽ di chuyển theo chiều nhất định với vận tốc tỷ lệ với độ lớn của thế zeta. Điện thế zeta là một chỉ số quan trọng của sự ổn định của sự phân tán trong dung dịch. Độ lớn của thế zeta cho thấy độ lớn lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt mang cùng điện tích gần nhau trong dung dịch. Đối với các phân tử và hạt đủ nhỏ, thế zeta cao sẽ mang lại sự ổn định, tức là dung dịch hoặc sự phân tán sẽ chống lại sự kết tụ. Khi điện thế nhỏ, lực hấp dẫn có thể vượt quá lực đẩy này và sự phân tán có thể bị phá vỡ và xảy ra hiện tượng kết tụ . Vì vậy, các dung dịch có thế zeta cao (âm hoặc dương) có độ ổn định cao trong khi các chất keo có thế zeta thấp có xu hướng đông tụ hoặc kết bông. Các mức thế tương ứng độ ổn định được nêu trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Độ ổn định của dung dịch hạt nano phụ thuộc vào thế bề mặt
Thế Zeta (mV) Độ ổn định
0 đến ± 5 Đông tụ hoặc keo tụ nhanh chóng
± 10 đến ± 30 Bắt đầu kết tụ
± 30 đến ± 40 Ổn định vừa phải
± 40 đến ± 60 Ổn định tốt
> 61 Ổn định tuyệt vời
Chuẩn bị mẫu đo: Bơm dung dịch nano vàng vào cuvet thạch anh trong suốt rồi đặt cuvet vào máy đo thế thế Zeta. Phép đo được thực hiện trên máy đo thế Zetasizer (NanoZS; Malvern Instruments, Malvern, UK). thuộc Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.15. Thiết bị đo thế Zeta Zetasizer tại Viện khoa học vật liệu - Viện
Hàn lâm Khoa học - Công nghệ Việt Nam
2.5. Phương pháp ly tâm phân đoạn
Nguyên lý đo: Máy ly tâm là máy thực hiện quá trình phân ly dựa vào trường lực ly tâm để phân riêng hỗn hợp hai pha rắn - lỏng hoặc lỏng - lỏng thành các cấu tử riêng biệt.
Một máy ly tâm gồm có 4 bộ phận chính, bộ phận quay: gồm một động cơ có vận tốc cao tạo lực ly tâm lớn, hệ thống giảm rung, giảm chấn động, rotor và adapter; bộ phận điều khiển: Gồm một mạch điện điều khiển có chức năng giúp cài đặt các chế độ làm việc phù hợp; Hệ thống cảm biến: Cảm biến đóng cửa, cảm biến bất đối xứng, cảm biến quá tải, quá dòng và cảm biến rotor; Thùng máy: Là một buồng kín nhằm đảm bảo quá trình ly tâm sẽ xảy ra trong một hộp kín và giữ ổn định nhiệt khi ly tâm ở nhiệt độ thấp ngoài ra còn có tác dụng đảm bảo an toàn cho quá trình ly tâm.
Khi quay dung dịch chứa các hạt nano ở tốc độ quay xác định sẽ sinh ra một lực ly tâm: R mv F 2 =
Trong đó: F là lực ly tâm; m khối lượng hạt nano; v tốc độ quay của máy ly tâm; R bán kính.
Hạt có kích thước khác nhau (khối lượng khác nhau) sẽ chịu tác dụng một lực ly tâm khác nhau. Ở dung dịch dạng huyền phù, các hạt cần phải có một lực ly tâm nhất định mới có thể thoát ra khỏi dung dịch và lắng vào thành ống ly tâm. Như vậy, mỗi hạt có kích thước khác nhau cần đạt một tốc quay đủ lớn để thoát ra khỏi dung dịch. Vậy khi ly tâm ở tốc độ khác nhau sẽ giúp thu được các hạt có dải kích thước khác nhau.
Chuẩn bị mẫu: Dung dịch nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lý vi sóng trong 10 phút được rót vào 4 ống ly tâm dung tích 10 ml. Bốn ống được cân trên cân có độ chính xác m0,01g nhằm đảm bảo độ cân bằng khi ly tâm. Sau đó các ống ly tâm được đưa vào máy ly tâm quay ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút và 15.000 vòng/phút. Quá trình ly tâm phân đoạn được thực hiện trên máy ly tâm lạnh UniCen MR tại Viện nghiên cứu nano, Trường Đại học Phenikaa.
Hình 2.16. Máy ly tâm lạnh UniCen MR tại Viện nghiên cứu nano - Trường
2.6. Khảo sát hiệu ứng quang nhiệt của dung dịch nano vàng
Nguyên lý đo: Các hạt nano kim loại quý như vàng hay bạc khi chiếu ánh sáng có bước sóng thích hợp sẽ xảy ra hiệu ứng Plasmon bề mặt đồng thời với nó là quá trình chuyển hóa quang năng thành nhiệt. Hình 2.17 mô tả hiệu ứng quang nhiệt trong các hạt nano vàng. Khi chiếu xạ (bức xạ nhìn thấy hoặc gần hồng ngoại theo dải plasmonic của hạt nano vàng), hạt nano vàng hấp thụ ánh sáng (hν, trái). Các sự hấp thụ năng lượng dẫn đến sự chuyển đổi điện tử của các điện tử bề mặt từ trạng thái cơ bản (S0) sang trạng thái trạng thái kích thích (S1). Năng lượng bức xạ ra môi trường dưới dạng nhiệt năng phát ra xung quanh các hạt nano vàng theo mọi hướng. Kết quả là nhiệt độ môi trường xung quanh các hạt nano vàng sẽ tăng lên.
Hình 2.17.Hiệu ứng quang nhiệt của hạt nano vàng [22]
Năm 2013 nhóm Ke Jiang [23] và cộng sự đã đánh giá sự phụ thuộc của hiệu ứng quang nhiệt vào kích thước hạt nano vàng. Hệ thí nghiệm được bố trí như sơ đồ ở Hình 2.18, sử dụng laze có bước sóng =532nmtương ứng với bước sóng hấp thụ plasmon của các hạt nano vàng.
Hình 2.18. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu ứng quang nhiệt của dung dịch
nano vàng [23]
Chuẩn bị mẫu:300ldung dịch nano vàng được ly tâm với tốc độ khác nhau được đưa vào các ống có dung tích 450l. Các mẫu được đưa vào các giá cách nhiệt với môi trường và được chiếu sáng bởi nguồn laze có tiết diện chùm sáng 2
12mm
và bước sóng 532 nm trong thời gian 20 phút. Nhiệt độ dung dịch được đo trong suốt quá trình chiếu laze bằng nhiệt kế HANNA- HI98501 (độ nhạy 0,1oC). Quá trình khảo sát được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu nano, Trường Đại học Phenikaa.
2.7. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các hạt nano vàng ở kích thước khác nhau khác nhau
2.7.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh kết hợp cùng hạt nano vàng khi có chiếu và không chiếu laze của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được đánh giá dựa trên kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán.
Huyền dịch vi khuẩn được lấy từ khuẩn lạc, dùng pipet lấy các khuẩn lạc (3 - 5 khuẩn lạc) có hình thái giống nhau hòa tan vào ống nước muối sinh
lý 0,9%, lắc đều để có huyền dịch đồng nhất. Điều chỉnh để độ dục của huyển dịch tương đương với độ đục chuẩn McFarland 0,5. Dùng pipet đã vô trùng hút 100 µl canh thang vi khuẩn lên đĩa thạch và dàn đều bằng que trang thủy tinh.
Khoanh giấy (Whatman, đường kính 6 mm), sau khi sấy vô trùng, được thấm đẫm với các dung dịch chứa PHMB, hạt nano vàng và hỗn hợp 2 dung dịch. Dùng panh kẹp vô trùng đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch. Các khoanh giấy sau khi đặt cần được ấn xuống nhẹ nhàng để chúng được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Khoanh giấy chứa nano vàng và PHMB được chiếu laze có bước sóng 532 ± 10 nm trong 10 phút. Các đĩa thạch được lật úp và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, qua đêm.
Hình 2.19.Kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán
Bảng 2.2. Các dung dịch thử nghiệm kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán
Au Kháng sinh Kháng sinh + Au Kháng sinh + Au + laze Au 100µl 100µl 100µl PHMB 0,05% 100µl 100µl 100µl H2O 100µl 100µl
2.7.2. Kỹ thuật cấy đếm
Kỹ thuật cấy đếm là kỹ thuật nuôi cấy nhằm xác định số lượng vi khuẩn có khả năng phát triển từ bệnh phẩm hoặc trong một huyền dịch vi khuẩn.
Dựa trên kỹ thuật cấy đếm để đánh giá tác động của hạt nano vàng khi có hiệu ứng quang nhiệt lên tế bào vi khuẩn. Huyền dịch vi khuẩn chuẩn bị như trên độ đục chuẩn McFarland 0,5. Pha loãng bậc mười từ huyền dịch ban đầu. Huyền dịch vi khuẩn ở các nồng độ được thêm vào các dung dịch có sẵn dung dịch nano vàng, PHMB và hỗn hợp 2 dung dịch, trộn đều bằng pipet. Với các mẫu có chứa hạt nano vàng, tiến hành chiếu laze có bước sóng 532 ± 10 nm trong 7 phút. Dùng que cấy (thủy tinh) đã tiệt trùng, cắm que cấy thẳng đứng, chỉ nhúng đầu que cấy xuống canh khuẩn, rồi ria một đường thẳng khoảng 1,2 cm lên đĩa thạch. Thay que cấy và tiếp tục ria với các mẫu khác. Sau đó, đặt úp đĩa thạch cho vào tủ ấm 37oC, nuôi qua đêm.
Bảng 2.3. Các dung dịch thử nghiệm cấy đếm
Kiểm chứng Au PHMB PHMB + Au Vi khuẩn 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl H2O 180 µl 20 µl 160 µl PHMB 0.05% 20 µl 20 µl Au 160 µl 160 µl 2.8. Kết luận
Trong chương này, đề tài đã mô tả các vật liệu, hóa chất, quy trình điều chế nano vàng cũng như thử nghiệm khả năng kháng/diệt khuẩn trên cơ sở hiệu ứng quang nhiệt. Các thiết bị hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao. Phép phân tích được chuẩn hóa của các phòng thí nghiệm hàng đầu ở Việt Nam.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phổ hấp thụ UV-vis
Dung dịch nano vàng đã được chế tạo thành công bằng phương pháp điện hóa từ vàng kim loại dạng khối. Trong nghiên cứu này, nano vàng sau chế tiếp tục được khảo sát khả năng phát triển hạt bằng cách xử lý vi sóng ở các điều kiện khác nhau. Hình 3.1 là ảnh của dung dịch vàng sau khi chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lý vi sóng. Quan sát bằng mắt thường thấy rằng tất cả các mẫu đều có màu đỏ tươi đặc trưng của nano vàng. Như vậy, có thể xác định sơ bộ rằng đã có sự hình thành nano vàng trong dung dịch sau điện hóa, màu sắc dung dịch không thay đổi dưới tác động của vi sóng. Một số nghiên cứu cho thấy rằng màu sắc của dung dịch nano vàng thay đổi khi kích thước hạt thay đổi [7][24]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, màu sắc dung dịch nano vàng thu được sau điện hóa và kết hợp xử lý vi sóng đều không nhận thấy sự thay đổi nào. Do vậy có thể giả định rằng nano vàng đã được hình thành trong quá trình điện hóa và chúng không bị ảnh hưởng bởi việc xử lý vi sóng, thậm chí tới 15 phút.
Hình 3.1. Dung dịch nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp
xử lý vi sóng theo thời gian khác nhau
Để có bằng chứng khoa học hơn, phổ hấp thụ UV-vis đã được thực hiện đối với các mẫu. Hình 3.2 cho thấy phổ hấp thụ UV-vis của các dung dịch
nano vàng sau điện hóa và điện hóa kết hợp xử lý vi sóng theo thời gian khác nhau. Đường màu đen là phổ hấp thụ của mẫu điện hóa không xử lý vi sóng, các đường màu đỏ, xanh, hồng, nâu và tím lần lượt là các mẫu điện hóa kết hợp xử lý vi sóng 1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút, và 15 phút. Từ phổ hấp thụ UV-vis thấy rằng tất cả các dung dịch đều có đỉnh hấp thụ tại 538 nm đây được cho là đỉnh hấp thụ của hạt nano vàng. Ngoài ra các mẫu kết hợp vi sóng có cường độ hấp thụ lớn hơn so với mẫu không vi sóng khi đo đạc cùng nguồn mẫu và cùng điều kiện đo. Điều này chứng tỏ dưới tác dụng của vi sóng khả năng hấp thụ của các hạt nano vàng được tăng cường.
Hình 3.2. Phổ UV-vis của nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa kết hợp xử lí vi sóng với thời gian khác nhau
3.2. Hình ảnh TEM
Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cũng được sử dụng để kiểm tra hình dạng và sự đồng đều của hạt nano vàng trong dung dịch theo các điều kiện xử lý vi sóng khác nhau. Tuy nhiên, thực tế quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chúng tôi không nhận thấy sự khác biệt kể cả về hình thái và kích thước. Những hình ảnh quan sát trên vi trường đều cho thấy phần lớn các hạt là hình cầu, nhưng cũng có những hạt hình dạng khác như tam giác, tứ
giác xen kẽ, tất cả những hạt này đều có kích thước trong dải 20 - 30 nm. Hình 3.3a cho thấy hình ảnh của mẫu điện hóa không vi sóng. Hình 3.3b, c, d, e và f đều là hình ảnh hạt nano vàng của tương ứng với các mẫu kết hợp xử lý vi sóng 1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút và 15 phút.
Hình 3.3. Ảnh TEM của các mẫu nano vàng xử lý bằng vi sóng theo thời gian khác nhau: (a) không vi sóng; (b) 1 phút; (c) 3 phút; (d) 5 phút; (e) 10 phút;
3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)
Hình 3.4. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa
Cấu trúc tinh thể của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa được khảo sát bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Hình 3.4 là giản đồ nhiễu xạ tia X của hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa từ hai điện cực vàng khối trong 3 giờ. Từ phổ XRD thấy rằng xuất hiện các đỉnh nhiễu xạ của các họ mặt tinh thể (111); (200); (220) và (311) tương ứng với các vị trí góc nhiễu xạ 2 là 37,38o; 43,52o; 63,94o và 77,22o đặc trưng của tinh thể vàng