6. Nội dung nghiờn cứu
2.1.1. Chất màu Rhodamine
Họ chất màu Rhodamine là một trong cỏc chất màu hữu cơ phỏt huỳnh quang (fluorophores) phổ biến. Rhodamine cựng với cỏc chất màu fluorescein (được sử dụng để giỳp chẩn đoỏn phỏt hiện cỏc tổn thương mắt như dị vật và trầy xước giỏc mạc) và eosin (thường được sử dụng để đỏnh dấu tế bào) đều là dẫn xuất của xanthene (phõn tử cú 3 mắt xớch 6 cạnh). Hỡnh 2.1 trỡnh bày cấu trỳc chung của xanthene và rhodamine.
Hỡnh 2.1. Cấu trỳc xanthene (bờn trỏi) và lừi của cỏc phõn tử rhodamine (bờn phải)
Họ chất màu Rhodamine là một trong những họ chất màu hữu cơ truyền thống được dựng phổ biến trong cỏc kỹ thuật đỏnh dấu huỳnh quang, ứng dụng trong cỏc xột nghiệm sinh húa và làm mụi trường khuếch đại laser. Rhodamine được sử dụng rộng rói làm đầu dũ huỳnh quang do hệ số hấp thụ cao và độ phỏt huỳnh quang rộng trong vựng nhỡn thấy của quang phổ súng điện từ, hiệu suất lượng tử huỳnh quang cao và khả năng phỏt quang khỏ ổn định. Cỏc thành viờn quan trọng của họ chất màu rhodamine được biết đến là Rhodamine 6G (R6G), Rhodamine 123 (R123) và Rhodamine B (RB). Trong điều kiện thực nghiệm của luận văn, đề tài thực hiện cỏc thớ nghiệm khảo sỏt tớnh chất quang của hai chất màu R6G và RB. Cỏc chất màu Rhodamine được mua của hóng Thermofisher Scientific; chỳng cú thể tan trong cỏc dung mụi nước, metanol và ethanol. RB cú màu hồng tớm và R6G cú màu vàng cam dưới ỏnh sỏng nhỡn thấy,
tuy nhiờn RB cú phỏt xạ huỳnh quang màu vàng và R6G cú phỏt xạ huỳnh quang màu xanh lỏ. Hỡnh 2.2 và 2.3 lần lượt trỡnh bày đặc trưng phổ của RB và R6G trong dung mụi nước, bao gồm phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang đó chuẩn húa. Cỏc thụng số của RB và R6G được trỡnh bày trờn bảng 2.1.
450 500 550 600 650 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 576 Phổ huỳnh quang Phổ hấp thụ B-ớc sóng (nm) C-ờn g độ chuẩn hóa RB 553 450 500 550 600 650 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 550 Phổ huỳnh quang Phổ hấp thụ B-ớc sóng (nm) C-ờ ng độ chuẩ n hó a 526 R6G
Hỡnh 2.2. Đặc trưng phổ của chất màu RB.
Hỡnh 2.3. Đặc trưng phổ của chất màu R6G.
Bảng 2.1. Cỏc thụng số chi tiết của RB và R6G
Chất màu Khối lƣợng phõn tử (Da) Hiệu suất lƣợng tử Đỉnh hấp thụ (nm) Đỉnh phỏt xạ huỳnh quang (nm) Hệ số dập tắt (M-1cm-1) RB 479 0.3 553 576 106000 R6G 479 0.93 526 550 116000 2.1.2. Cỏc hạt nano vàng dạng keo
Cỏc hạt nano vàng được sử dụng trong nội dung nghiờn cứu của luận văn là cỏc hạt keo vàng của hóng BBI Solutions (UK) với cỏc kớch thước là trung bỡnh ~20nm. Cỏc hạt nano vàng này được chế tạo cú cỏc phõn tử citrate trờn bề mặt giỳp chỳng phõn tỏn tốt trong nước. Dung dịch của cỏc hạt nano vàng này cú màu hồng
nhạt (hỡnh 2.4) do hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Ảnh chụp kớnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy cỏc hạt keo nano vàng này cú dạng phỏng cầu, kớch thước khỏ đồng đều và đơn phõn tỏn trong nước. Hỡnh 2.5 trỡnh bày phổ hấp thụ cộng hưởng plasmon của dung dịch hạt keo vàng kớch thước 20 nm. Đỉnh hấp thụ cộng hưởng plasmon quan sỏt thấy ở bước súng ~ 523 nm. Phộp đo phổ hấp thụ được tiến hành trờn hệ mỏy quang phổ UV-VIS-NIR Absorption Spectrophotometer (hiệu Cary 5000, Varian) cú ở Viện Vật lý, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Hệ số dập tắt ε và nồng độ hạt vàng trong dung dịch cú thể được tớnh dễ dàng từ độ hấp thụ của dung dịch cỏc hạt keo vàng.
Hỡnh 2.4. Dung dịch nước cỏc hạt nano vàng dạng keo kớch thước
20nm.
Hỡnh 2.5. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của cỏc hạt nano vàng kớch thước ~20nm. 400 450 500 550 600 650 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 523 Độ hấp t hụ chu ẩn hóa B-ớc sóng (nm)
Phộp đo phổ hấp thụ được tiến hành trờn hệ mỏy quang phổ UV-VIS- NIR Absorption Spectrophotometer (hiệu Cary 5000, Varian) cú ở Viện Vật lý, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Từ độ hấp thụ của dung dịch cỏc hạt keo vàng, chỳng ta cú thể tớnh được hệ số dập tắt ε và nồng độ hạt vàng trong dung dịch.
Nồng độ mol (mol/L) được tớnh từ độ hấp thụ A từ đỉnh hấp thụ plasmon của hạt vàng như sau:
C = A/ (ext . ℓ) (2.1)
trong đúℓ là độ dài mẫu mà ỏnh sỏng đi qua. Nếu lấy ℓ = 1 đơn vị ta sẽ cú nồng mol là C = A/ext. Hệ số dập tắt ext được tớnh theo cụng thức Mie (1.22); hệ số khỳc xạ (hàm điện mụi của vàng) được lấy dữ liệu từ tài liệu tham khảo [31] và sử dụng phần mềm tớnh [30] sử dụng lý thuyết Mie, chỳng ta cú được kết quả gần đỳng về hệ số dập tắt của cỏc hạt nano vàng là 9,43108 M-1cm-1. Hệ số dập tắt này lớn hơn nhiều so với hệ số dập tắt của cỏc phõn tử chất màu Rhodamine ở bảng 2.1.
2.2. Mụ hỡnh thớ nghiệm
Thớ nghiệm được tiến hành dựa trờn sự khảo sỏt tớnh chất quang của cỏc dung dịch chất màu Rhodamine được pha với nồng độ cho trước, sau đú thờm cỏc lượng hạt vàng nhất định vào dung dịch chất màu và khảo sỏt sự thay đổi cỏc tớnh chất hấp thụ, huỳnh quang, hiệu suất lượng tử và thời gian sống phỏt quang. Nồng độ chất màu phải được xỏc định trước để khi cho cỏc hạt nano vàng vào trong dung dịch thỡ sẽ quan sỏt được cả hai hiệu ứng, tăng cường và dập tắt huỳnh quang do hiệu ứng plasmon bề mặt từ cỏc hạt nano vàng. Thụng số của cỏc dung dịch chất màu Rhodamine được cho như trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cỏc thụng số của dung dịch chất màu chất phỏt quang
Phần tử chất phỏt quang Nồng độ
RB 4,01017 phõn tử màu/ mL R6G 3,21017 phõn tử màu/ mL
2.3. Cỏc phộp đo thực nghiệm 2.3.1. Phộp đo phổ hấp thụ 2.3.1. Phộp đo phổ hấp thụ
Phổ hấp thụ là đường biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ α của mụi trường vật chất vào bước súng của ỏnh sỏng tới.
Chiếu một chựm tia sỏng đơn sắc cú cường độ I0 song song vào một mụi trường vật chất cú bề dày l (cm) và nồng độ C (mol/l), chựm tia này sẽ bị mụi trường hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chựm tia truyền qua mụi trường này bị giảm theo định luật Lambert - Beer:
ln (I0/I) = K (2.2)
hay: ln (I0/I)= lC (2.3)
Trong đú: K- là hệ số hấp thụ
- số mol chất nghiờn cứu đặt trờn đường đi của bức xạ
Đại lượng ln(I0/I) gọi là mật độ quang (D) hay độ hấp thụ (A), là hệ số tắt cú giỏ trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất hấp thụ bằng một đơn vị và độ dày chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số chỉ phụ thuộc vào vật liệu hấp thụ và bước súng.
Độ truyền qua của mụi trường: T= I / I0 (2.4)
Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vựng phổ, cho nờn để thuận lợi, người ta thường biểu diễn và xem xột từng vựng phổ riờng biệt như vựng tử ngoại, khả kiến, hồng ngoại.Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ vào tần số hoặc bước súng gọi là đường cong hấp thụ (hay phổ hấp thụ). Mỗi chất đều hấp thụ lọc lựa những tần số hay bước súng khỏc nhau.
Nguyờn tắc đo phổ hấp thụ:
Nếu ta gửi một bức xạ đơn sắc cường độ I0() tới một mẫu đồng thể cú độ dài l, cường độ I() cũn lại ở lối ra khỏi mẫu thỡ nhỏ hơn I0(). Thường thường ta quan tõm tới độ truyền qua T () = I()/ I0(). Đụi khi người ta quan tõm tới độ hấp thụ A() = - log10 T(). Cỏc phổ được vẽ với cỏc thiết bị truyền thống là
với "chựm sỏng đỳp" cho một cỏch trực tiếp độ truyền qua T(). Với kỹ thuật mỏy tớnh hiện nay người ta cũng dựng một cỏch dễ dàng cả độ truyền qua và độ hấp thụ.
Cỏc mỏy quang phổ được dựng giống như sự bố trớ cỏc mỏy tỏn sắc, gồm cỏc lăng kớnh NaCl hoặc tốt hơn là cỏc cỏch tử với cỏc kớnh lọc giao thoa. Hệ quang học với hai chựm tia cho phộp nhận được trực tiếp tỷ lệ I / Iref. giữa cường độ I của chựm đó xuyờn qua mẫu và cường độ I của chựm đó xuyờn qua phần mẫu so sỏnh. Sự so sỏnh trực tiếp này cho phộp bảo đảm rằng phổ I () và I ref. () được ghi trong cựng một điều kiện. Cỏc phộp đo phổ hấp thụ được tiến hành trờn hệ mỏy quang phổ UV-visible-Nir Absorption Spectrophotometer (nhón hiệu Cary 5000, Varian) cú ở Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Sơ đồ hệ đo hấp thụ được trỡnh bày trờn hỡnh 2.7.
Hỡnh 2.7. Sơ đồ hệ đo hấp thụ quang UV-Vis.
2.3.2. Phộp đo phổ huỳnh quang
Hiện tượng huỳnh quang cú nguồn gốc từ cỏc chuyển dời bức xạ giữa cỏc mức năng lượng của điện tử khi vật liệu bị kớch thớch. Nếu phõn tử hấp thụ ỏnh sỏng trong vựng nhỡn thấy hoặc vựng tử ngoại thỡ năng lượng hấp thụ sẽ ứng với cỏc mức điện tử như vậy sẽ cú chuyển dời điện tử trong phõn tử từ quỹ đạo này sang quỹ đạo khỏc. Phổ huỳnh quang biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ huỳnh
quang vào bước súng phỏt xạ dưới kớch thớch bằng ỏnh sỏng dưới bước súng nhất định nào đú. Từ trạng thỏi kớch thớch, điện tử trở về trạng thỏi cơ bản bằng cỏc con đường khỏc nhau: hồi phục khụng bức xạ và hồi phục bức xạ.
Phổ huỳnh quang là hàm phõn bố năng lượng bức xạ của chất huỳnh quang theo tần số hay bước súng. Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần và cấu trỳc của cỏc tõm bức xạ và cỏc tỏc nhõn bờn ngoài và cú một số đặc điểm sau:
(1) Tần số huỳnh quang của cỏc chất màu luụn bộ hơn tần số của ỏnh sỏng kớch thớch. Nghĩa là năng lượng huỳnh quang nhỏ hơn năng lượng dựng để kớch thớch huỳnh quang.Tần số huỳnh quang trong trường hợp này gọi là tần số Stokes.
(2) Dạng phổ huỳnh quang khụng phụ thuộc vào năng lượng ỏnh sỏng kớch thớch vỡ sau khi kớch thớch chỉ cần một thời gian rất ngắn, sự phõn bố cỏc phõn tử trờn cỏc trạng thỏi kớch thớch sẽ tuõn theo phõn bố Boltzman.
(3) Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào cỏc tạp chất nằm trong mẫu. Những tạp chất này ảnh hưởng lớn đến phổ huỳnh quang và trong nhiều trường hợp làm tắt ỏnh sỏng huỳnh quang. Những chất này gọi là chất tắt.
Hỡnh 2.9. Cấu hỡnh chi tiết của một mỏy phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse
Sơ đồ khối hệ đo huỳnh quang:
Hỡnh 2.8 mụ tả sơ đồ khối của hệ đo huỳnh quang: Tớn hiệu kớch thớch từ nguồn sỏng được chiếu lờn mẫu để kớch thớch cỏc điện tử từ trạng thỏi cơ bản lờn cỏc trạng thỏi kớch thớch. Tớn hiệu huỳnh quang được phõn tớch qua mỏy đơn sắc và thu nhận tớn hiệu qua đầu thu để biến đổi thành tớn hiệu đưa ra xử lý. Một photodiode được đặt trước mẫu để theo dừi sự thay đổi cụng suất nguồn sỏng kớch thớch. Phổ huỳnh quang của cỏc mẫu được đo trờn phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse, nguồn kớch là đốn Xenon (hỡnh 2.9) tại Trung tõm Điện tử lượng tử, Viện Vật lý, Viện khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Ngoài việc khảo sỏt tớnh chất phỏt xạ huỳnh quang của cỏc chất phỏt quang khi cú mặt cỏc hạt nnao vàng bằng bước súng kớch thớch 532 nm của đốn Xenon, chỳng tụi cũn khảo sỏt bằng kớch thớch 532 nm của Laser diod ở ở Viện Vật lý.
2.3.3. Phộp đo thời gian sống phỏt quang
Thời gian sống phỏt quang (thời gian sống huỳnh quang) dựng để chỉ thời gian trung bỡnh mà phõn tử (nguyờn tử, điện tử) vẫn tồn tại trong trạng thỏi kớch thớch của nú trước khi phỏt ra một photon. Thời gian sống phỏt huỳnh quang được
Nguồn sỏng Đốn Xờ -nụn Mỏy đơn sắc Cửa sập Kớnh lọc Tấm chia chựm Tấm phõn cực Ref - Cell Mụđun quang học Mỏy đơn sắc Buồng đựng mẫu Điều khiển mỏy đơn sắc Mỏy tớnh Hiển thị
đo bằng phổ kế huỳnh quang phõn giải theo thời gian. Cú hai phương phỏp đo huỳnh quang phõn giải thời gian được phỏt triển đú là phộp đo miền tần số và phộp đo miền thời gian. Đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPC) là một kỹ thuật đo trực tiếp với độ nhạy cao và là kỹ thuật phổ biến nhất trong phộp đo miền thời gian. TCSPC hoạt động trờn cơ sở phỏt hiện đơn photon trong từng chu kỳ tớn hiệu của ỏnh sỏng kớch thớch, đo thời gian phỏt hiện photon và dựng lại dạng xung từ cỏc tớn hiệu đo trong cỏc khoảng thời gian độc lập với nhau, tức là xõy dựng lại biểu đồ cường độ tớn hiệu theo thời gian [1]. Điều kiện cơ bản của phộp đo TCSPC là tớn hiệu mẫu phải rất nhanh, cú độ lặp lại cao và đủ yếu sao cho mỗi chu kỳ của tớn hiệu khụng cú nhiều hơn 1 photon được phỏt hiện. Dựa trờn khả năng đỏp ứng của cỏc thiết bị trong hệ TCSPC hiện nay thỡ mức phỏt hiện tối ưu cần đạt là 1 photon trờn 100 xung kớch thớch.
Hỡnh 2.10 mụ tả nguyờn lý chung của một hệ đo TCSPC, trong mỗi chu kỳ tớn hiệu chỉ cú 1 xung đơn photon được phõn bố một cỏch ngẫu nhiờn, cú nhiều chu kỳ tớn hiệu thậm chớ cũn khụng cú xung photon nào. Khi một photon được phỏt hiện thỡ thời gian tương ứng khi phỏt hiện đơn photon trong chu kỳ tớn hiệu sẽ được ghi nhận. Sự kiện này sẽ được ghi trong bộ nhớ cú địa chỉ tương ứng với thời gian phỏt hiện photon, cỏc photon trong cỏc chu kỳ tớn hiệu khỏc nhau nhưng nếu cú cựng thời gian phỏt hiện thỡ được xếp vào cựng một kờnh thời gian theo cơ chế cộng dồn.
Hỡnh 2.10.Nguyờn lý tổng quỏt của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian [1].
Hỡnh 2.11. Cường độ huỳnh quang phõn giải theo thời gian sử dụng TCSPC [1].
Sau rất nhiều chu kỳ tớn hiệu xung huỳnh quang sẽ được tổng hợp xõy dựng lại trong bộ nhớ và hiển thị ra màn hỡnh. Trong trường hợp đếm tốc độ cao thỡ cỏc kờnh thời gian cũng phải được điều chỉnh ngắn hơn để thỏa món điều kiện mỗi chu kỳ tớn hiệu chỉ phỏt hiện được khụng quỏ 1 một photon. Để đỏp ứng được nguyờn lý hoạt động núi trờn, cỏc hệ TCSPC được trang bị những cụng cụ hết sức đặc thự như bộ chọn ngưỡng phõn phần khụng đổi CFD (Constant Fraction Discriminator) và bộ biến đổi thời gian biờn độ TAC (Time to Amplitude Converter), bộ phõn tớch đa kờnh MCA (Multichannel Analyzer) … Hỡnh 2.11 trỡnh bày phộp đo suy giảm huỳnh quang sử dụng TCSPC. Cỏc mẫu chất màu được đo huỳnh quang phõn giải theo thời gian sử dụng hệ TCSPC cú ở Trung tõm Điện tử lượng tử, Viện Vật lý, Viện hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Hệ TCSPC ở Viện Vật lý sử dụng nguồn kớch laser diode phỏt xung pico giõy tại bước súng 405 nm, tần số lặp lại cú thể thay đổi được từ 4 - 50 MHz, độ rộng xung dưới 100 ps. Detector thu xung photon được sử dụng là PMT R7400U của Hamamatsu, thời gian đỏp ứng là 700 ps và card FPGA đọc tớn hiệu ra mỏy tớnh. Thời gian sống phỏt quang cũng được gửi đo bởi hệ đo Spectra - Physics MaiTai cú tại Trường Đại học ENS Cachan, Phỏp với nguồn kớch là laser Ti: Sapphire xung 80fs, tần số lặp lại 8 MHz, cú thể phỏt cỏc bước súng liờn tục từ 700 đến 1020 nm. Việc nhõn tần được thực hiện để cú cỏc kớch thớch ở bước súng trong vựng UV - vis; bức xạ huỳnh quang được thu bằng ống nhõn quang điện vi kờnh (microchannel plate photomultiplier) Hamamatsu R1564U-06, xử lý bằng SPC-430 card (Becker-Hickl GmbH).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của hiệu ứng plasmon của cỏc hạt nano vàng lờn tớnh chất phỏt xạ của chất màu RB
3.1.1. Tớnh chất quang của dung dịch chất màu RB - hạt nano vàng kớch thƣớc 20 nm trong mụi trƣờng nƣớc thƣớc 20 nm trong mụi trƣờng nƣớc
Chất màu RB được pha trong nước với nồng độ 4,01017 phõn tử màu/ mL, nồng độ này tương ứng với điều kiện quang tuyến tớnh của RB. Đề tài thừa hưởng cỏc kết quả nghiờn cứu đi trước trong nhúm nờn chọn nồng độ này của chất màu RB để khảo sỏt. Nếu nồng độ thấp hơn vài lần, huỳnh quang sẽ khú