3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro
2.2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt
Chuẩn bị mẫu: Trước khi khử trùng phải tiến hành chọn lọc những hạt tốt, không lép, màu nâu sẫm và được ngâm trong nước cất để loại lớp vỏ
lụa mỏng bao ngoài. Sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất và khử trùng theo công thức.
Sử dụng các hóa chất (như cồn, javen, HgCl2 0,1% và axit HCl đặc) với nồng độ và thời gian khác nhau để tìm công thức vô trùng mẫu hiệu quả nhất. Đối với công thức KT1 và KT2, việc khử trùng được thực hiện trong bình kín và đặt trong box cấy vô trùng. Đối với công thức KT3, KT4 và KT5, hạt sau khi bỏ lớp vỏ lụa được đặt trong các đĩa bằng giấy thấm, xếp vào chuông thủy tinh, sử dụng khí Clo (được tạo bởi dung dịch javen 20ml và axit HCl đặc 5ml) để khử trùng hạt trong các khoảng thời gian 4, 5 và 6 giờ, thí nghiệm được tiến hành trong chuông thủy tinh và đặt trong tủ hút. Sau khi được khử trùng, hạt được gieo trên môi trường gồm MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8,5 g/l. Thí nghiệm gồm 5 công thức. Mỗi công thức gieo 5 bình, mỗi bình 25 hạt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là: tỷ lệ hạt nhiễm và tỷ lệ hạt không nhiễm nảy mầm. Công thức khử trùng được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng
Công thức Thời gian xử lý (phút)
Cồn 70o Javen 70% HgCl2 0,1% Clo KT1 1 20 0 0 KT2 1 20 5 0 KT3 0 0 0 240 KT4 0 0 0 300 KT5 0 0 0 360
2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu môi trường kích thích hạt nảy mầm
Hạt sau khi khử trùng được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và các chất kích thích sinh trưởng (BAP, GA3) với các nồng độ lần lượt là 0,5 mg/l và 1,0 mg/l. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7-5,8. Thí nghiệm gồm 4 công thức. Mỗi công thức
môi trường gieo 5 bình, mỗi bình 25 hạt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ hạt nảy mầm.
2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng
Để thấy được ảnh hưởng của loại chất phụ gia đến sự sinh trưởng, phát triển của cây Đông hầu vàng, các loại môi trường được khảo sát gồm: (1) môi trường bổ sung nước dừa; (2) môi trường bổ sung dịch chiết chuối; (3) môi trường bổ sung dịch chiết khoai tây; (4) môi trường bổ sung dịch chiết cà chua; (5) môi trường bổ sung than hoạt tính. Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + chất phụ gia (nồng độ lần lượt là 50; 100; 150 và 200 ml/l đối với các loại dịch chiết hoặc nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 g/l đối với than hoạt tính). Trong đó, mỗi loại dịch chiết được tạo ra bằng cách nghiền 200g chất chiết dạng tươi đun sôi trong 1000ml nước cất. Cắt thân của cây Đông hầu vàng thành các đoạn dài khoảng 1-1,5cm, mỗi đoạn chứa một nách lá mầm, cắt bỏ lá, đem cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của cây sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7-5,8.
2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm cytokinin và auxin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng
(1) Ảnh hưởng của nhóm cytokinin: Để tìm được môi trường nhân
giống phù hợp đối với cây Đông hầu vàng, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây Đông hầu vàng. Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm này là môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5
mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Đối chứng là môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8,5 g/l.
(2) Ảnh hưởng của tổ hợp nhóm cytokinin và nhóm auxin: Từ kết quả
nồng độ BAP và kinetin tốt nhất cho sự hình thành chồi, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và nhóm auxin đến sự hình thành chồi của cây Đông hầu vàng. Dùng nồng độ cytokinin (BAP hoặc kinetin) tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với NAA hoặc IBA nồng độ 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/l. Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng.
Phương pháp: Cắt thân của cây Đông hầu vàng thành các đoạn dài khoảng 1-1,5cm, mỗi đoạn chứa một nách lá mầm. Cắt bỏ lá, đem cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của cây sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25- 27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7- 5,8.
2.2.2.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng
Lá cây Đông hầu vàng được lấy từ nguồn vật liệu sạch nuôi cấy in vitro. Sau đó, cắt bỏ phần rìa lá, cắt lá thành các mảnh có kích thước dài 1cm, rộng 1cm rồi đặt úp mảnh lá vào môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và 2,4- D với các nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l. Mỗi công thức tiến hành trên 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Đặt các bình nuôi cấy trong bóng tối 1 tuần sau đó chuyển ra môi trường sáng. Theo dõi khả năng tạo mô sẹo của mẫu, chọn ra môi trường cho mẫu mô sẹo tốt nhất cung cấp nguyên liệu cho thí nghiệm tái sinh chồi từ mô sẹo.
Sau khi có nguồn mô sẹo, tiến hành tái sinh chồi từ mô sẹo trong các môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và BAP (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Mỗi công thức tiến hành trên 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu và lặp lại thí nghiệm 3 lần. Đánh giá kết quả sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi.
2.2.2.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng
Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) với các nồng độ lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l. Môi trường đối chứng là môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 mg/l và agar 8,5 g/l. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7- 5,8.
Phương pháp: Cắt chồi ngọn của cây Đông hầu vàng khoảng 2-3cm, cắt
bớt lá, cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình 6 chồi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi sự phát triển của cây sau 6 tuần và 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu ra rễ, số rễ/mẫu, chất lượng rễ.
2.2.2.7. Phương pháp nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên
Sử dụng các thành phần: đất thịt trung bình, cát, phân vi sinh EM làm giá thể nghiên cứu. Xử lý bằng vôi và phơi ải đối với thành phần đất thịt trung bình, rửa sạch, phơi khô đối với cát. Sau đó phối trộn các thành phần với nhau theo các công thức nghiên cứu ở bảng 2.2.
Đóng giá thể thành các bầu, mỗi loại giá thể tạo 30 bầu, mỗi bầu trồng 1 cây. Chọn cây đã được cấy trong môi trường tạo rễ sau 8 tuần có đủ rễ (≥ 3 rễ), đủ lá (≥ 8 lá), đủ chiều cao (≥ 7cm), mập và khỏe, đặt trong điều kiện nhiệt độ
phòng bình thường, bỏ nắp giấy và nút bông, để khoảng 24h. Sau đó lấy cây ra khỏi bình đem trồng trong các giá thể nghiên cứu. Theo dõi sự phát triển của cây sau thời gian 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ cây sống và chiều cao cây.
Bảng 2.2. Công thức giá thể ra cây Đông hầu vàng Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ các thành phần ĐC Đất thịt trung bình 1 CT1 Cát 1 CT2 Đất thịt trung bình : Cát 2:1
CT3 Đất thịt trung bình : Phân vi sinh 2:1 CT4 Đất thịt trung bình: Cát : Phân vi sinh 2:1:1