3. Nội dung nghiên cứu
3.6. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên
Lựa chọn giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài vườn ươm cũng là một khâu quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi
trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ... Khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác nên cây con dễ bị chết do mất nước, nhiệt độ cao... Vì thế cây con phải được thích nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên. Trước khi đem cây ra trồng ngoài vườn ươm, đưa cây ra khỏi phòng cây, đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng bình thường, bỏ nắp giấy và nút bông, để khoảng 24h. Sau đó lấy cây ra khỏi bình, đem trồng trong các giá thể nghiên cứu. Trong thời gian cây con thích nghi với điều kiện môi trường (tối thiểu là khoảng 2-3 tuần), cây con cần được chăm sóc và bảo vệ cẩn thận.
Cây con sau khi được đưa ra khỏi bình (Hình 3.8) sẽ được trồng vào các loại giá thể. Các bầu này được cho vào các khay, đặt nơi ánh sáng khuếch tán,
thoáng mát, tưới đủ ẩm mỗi ngày để cây con dần thích nghi với điều kiện bên ngoài. Tỷ lệ cây con sống sau 8 tuần trên các loại giá thể khác nhau thu được ở bảng 3.12 và hình 3.9.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 8 tuần Công thức Số cây trồng Số cây sống Tỷ lệ cây sống (%)
Chiều cao cây (cm) ĐC 30 24 80,00 6,06 ± 0,60 CT1 30 17 56,67 4,01 ± 0,66 CT2 30 25 83,33 6,25 ± 0,53 CT3 30 15 50,00 6,10 ± 1,15 CT4 30 27 90,00 9,19 ± 0,65
Kết quả bảng 3.12 cho thấy, giá thể là đất thịt trung bình: phân vi sinh có tỷ lệ cây sống rất thấp (50,00%), do cây con đang còn non yếu mà lại được trồng trong giá thể có lượng phân vi sinh lớn nên cây không thích nghi được. Kết quả có 15 cây sống trên tổng số 30 cây được trồng.
Hình 3.8. Cây Đông hầu vàng sau khi lấy ra khỏi bình
ĐC CT2 CT5 Hình 3.9. Cây Đông hầu vàng in vitro trong vườn ươm
Đối với giá thể là cát, tỷ lệ cây sống thấp (56,67%) do cây con đang còn non được trồng trong giá thể không tơi xốp, khi tưới nước, cát nén chặt xuống làm cây phát triển kém và không thích nghi được với loại giá thể này.
Đối với giá thể là đất thịt trung bình và đất thịt trung bình: cát, tỷ lệ cây sống đạt lần lượt là 80,00; 83,33%. Tỷ lệ này tương đối cao nhưng đây không phải là giá thể thích hợp để trồng cây vì một số cây con không thích nghi được đã bị chết và cây con phát triển còn chậm.
Trên giá thể đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh, tỷ lệ cây con sống cao (đạt 90,00%), cây mập, khỏe, lá to, xanh thẫm, dày bản, chiều cao cây trung bình đạt 9,19cm. Như vậy, trong phạm vi của thí nghiệm này, giá thể phù hợp giai đoạn luyện cây trong vườn ươm là giá thể gồm đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1.
Như vậy, dựa trên kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng và chất phụ gia đến sự sinh trưởng, phát triển của cây in vitro, quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng phù hợp là:
Khử trùng hạt Đông hầu vàng bằng khí Clo trong 5 giờ Gieo hạt Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 0,5 mg/l để hạt nảy mầm Tạo đa chồi cây Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA 0,3 mg/l
Tạo rễ cây Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l
Đưa cây ra vườn ươm trong giá thể có thành phần: Đất thịt trung bình: Cát: Phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng được nghiệm thu là:
1.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng thích hợp là khử trùng bằng khí Clo trong 5 giờ. Tỷ lệ hạt không nhiễm là 100%.
1.2. Công thức môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm trong ống nghiệm thích hợp là môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 0,5 mg/l Tỷ lệ hạt nảy mầm là 75,56%.
1.3. Công thức môi trường tạo đa chồi cây Đông hầu vàng thích hợp là môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA 0,3 mg/l. Sau 8 tuần, số chồi/mẫu là 2,43, chất lượng các chồi tốt (chồi mập, khỏe).
1.4. Công thức môi trường tạo rễ và cây Đông hầu vàng hoàn chỉnh là môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l. Sau 8 tuần, số rễ/mẫu là 1,89, chất lượng các rễ tốt (rễ dài, nhiều).
1.5. Công thức giá thể phù hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra vườn ươm là đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1. Tỷ lệ sống sót là 90%, sau 8 tuần thu được cây cao 9,19 cm.
2. Kiến nghị
Tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Đông hầu vàng đến giai đoạn ra hoa, thu quả. So sánh và phân tích hàm lượng dược chất trong cây tự nhiên và cây in vitro.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Phan Thi Thuy, Pham Thi Thanh Nhan (2018), “Study on sterilizing plant materials and effects of cytokinin and 2,4- D on shoot formation of “Yellow alder” (Turnera ulmifolia)”, The 5th Academic Conference on Natural Science for Young Scientists, Master and PhD. Students from Asean Countries, 177-183.
2. Phan Thị Thúy, Phạm Thị Thanh Nhàn (2018), “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia và tổ hợp kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia L.) in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ,
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y tế và Bộ Khoa học & công nghệ (2009), Báo cáo Hội nghị tổng kết 20 năm thực hiện nhiệm vụ “Bảo tồn nguồn gen và giống cây thuốc (1998 - 2008)”, 189 trang.
2. Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 3. Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), “Kết quả bước
đầu nhân giống in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.)
bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học”,
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 450-453.
4. Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2004), “Nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở vường quốc gia Cúc Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học – Journal of Biotechnology, 2(4): 479-486.
5. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học và kĩ thuật.
6. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam.
8. Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây Hồng môn và cây Cúc nuôi cấy
in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3): 377-388.
9. Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội.
10.Lê Ánh Nguyệt, Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền và Lê Xuân Đắc (2010), “Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt châu (Micromelum hisutum Oliv.) của vườn quốc gia Cúc Phương”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 26(2): 180-186.
11.Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), “Nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724.
12.Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật và ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên.
13.Lê Thị Xuân, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996), “Cây Thông đỏ Lâm Đồng (Taxus walli chiana) một nguồn nguyên liệu quí để sản xuất các thuốc chữa ung thư nhóm Taxoid”, Tạp chí hóa học, 34(1): 80-81.
Tiếng Anh
14. Adhikarimayum H, Kshetrimayum G, Huidrom S, Maibam D (2011), “In vitro propagation of Citrus megaloxycarpa”, Environmental and Experimental Biology, (9): 129-132.
15. Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, “Ignacimuthu S (2008), “Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A valuable medicinal
phant”, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441. 16. Barrett SCH (1978), “Heterostyly in a tropical weed: the reproductive biology
of the Turnera ulmifolia complex (Turneraceae)”, Canadian Journal of Botany, 56(15): 1713-1725.
17. Bedir E, Lata H, “Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), “Micropropagation of
Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species”, Planta Med: 86-88.
18.Benitez-Vieyra S, Ordano M, Fornoni J, Boege K, Domínguez CA (2010), “Selection on signal–reward correlation: limits and opportunities to the evolution of deceit in Turnera ulmifolia L.”, J Evol Biol, 23(12): 2760-7. 19.Brito NJ, López JA, do Nascimento MA, Macêdo JB, Silva GA, Oliveira
CN, de Rezende AA, Brandão-Neto J, Schwarz A, Almeida Md (2012), “Antioxidant activity and protective effect of Turnera ulmifolia Linn. var. elegans against carbon tetrachloride-induced oxidative damage in rats”,
Food Chem Toxicol, 50(12): 4340-7.
20.Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira JP Jr (2009), “Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic activity against methicillin–resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L.”, BMC Complement Altern Med, 9: 13.
21. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, “Siqueira-Júnior JP (2010), Increasing of the aminoglicosyde antibiotic activity against a multidrug- resistant E. coli by Turnera ulmifolia L. and chlorpromazine”, Biol Res Nurs, 11(4): 332-5.
22. Daud N, Taha RM, Noor NN, Alimon H (2011), “Effects of different organic additives on in vitro shoot regeneration of Celosia sp”, Pak J Biol Sci, 14(9):
546-51.
23.Galvez J, de Souza Gracioso J, Camuesco D, Galvez J, Vilegas W, Monteiro Souza Brito AR, Zarzuelo A (2006), “Intestinal antiinflammatory activity of a lyophilized infusion of Turnera ulmifolia in TNBS rat colitis”,
Fitoterapia, 77(7-8): 515-20.
24.Gracioso Jde S, Vilegas W, Hiruma-Lima CA, Souza Brito AR (2002), “Effects of tea from Turnera ulmifolia L on mouse gastric mucosa support
the Turneraceae as a new source of antiulcerogenic drugs”, Biol Pharm Bull, 25(4): 487-91.
25.Hoang VD, Tan GT, Zhang HJ, Tamex PA, Hung NV, Cuong NM, Soejarto Đ, Fong HH, Pezzuto JM (2002), “Natural anti – HIV agents part I: (+)- demethoxyepiexcelsin and verticillatol from Litsea verticillata”, Phytochemistry, 59(3): 325-329.
26. Kalidass C, Mohan VR (2009), “In vitro Rapid clonal propagation of
Phyllanthus urinaria Linn (Euphorbiaceae)”, A Medicinal Plant, 1(4): 56-59.
27.K Kalimuthu R Prabakaran and V Preeetha (2014), “Antibacterial activity of diferent solvent extracts of Ceropegia pusillain in vitro tuber (wight and ARN.) an andemic, medicinal plant”, World Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 3(8): 785-793.
28. Liu X, Hou X (2018), “Antagonistic Regulation of ABA and GA in Metabolism and Signaling Pathways”, Front Plant Sci, 9:251.
29. Mohammad HR (2013), “In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis”, Plant Knowledge Journal, Southern Cross Publishing Group, 2(4): 150-156.
30.Nascimento MA, Silva AK, França LC, Quignard EL, López JA, Almeida MG (2006), “Turnera ulmifolia L. (Turneraceae): Preliminary study of its antioxidant activity”, Bioresour Technol, 97(12): 1387-91.
31.Oliveira AF, Costa Junior LM, Lima AS, Silva CR, RibeiroMN, Mesquista JW, Rocha CQ, Tangerina MM, Vilegas W (2017), “Anthelmintic activity of plant extracts from Brazilian savanna”, Veterinary Parasitology, 236:
121- 127.
32.Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), “Improved in vitro plant regeneration
and micropropagation of Rehmannia glutinosa L.”, Journal of Medicinal Plants, 3(1): 031-034.
33. Park AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), “Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered medicinal plant”, Planta Med, 69(6): 571-573.
34.Pino JA (2010), “Essential oil of Turnera ulmifolia leaves from Cuba”, Nat
Prod Commun, 5(11): 1829-30.
35.Samuel K, Debashish D, Madhumita B, Padmaja G, Siva RP, Murthy BRV, Rao PS (2009), “In vitro germination and micropropagation of Givotia rottleriformis Griff”, In vitro Cellular & Developmental Biology.
36.Santos KK, Matias EF, Souza CE, Tintino SR, Braga MF, Guedes GM, Nogueira LF, Morais EC, Costa JG, Menezes IR, Coutinho HD (2012), “Anti-Candida activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia”, J Med
Food, 15(3): 322-4.
37. Savelieva EM, Oslovsky VE, Karlov DS, Kurochkin NN, Getman IA, Lomin SN, Sidorov GV, Mikhailov SN, Osolodkin DI, Romanov GA (2018), “Cytokinin activity of N6-benzyladenine derivatives assayed by interaction with the receptors in planta”, in vitro, and in silico, Phytochemistry, 149: 161-177. 38.Szewczyk K, Zidorn C (2014), “Ethnobotany, phytochemistry, and
bioactivity of the genus Turnera (Passifloraceae) with a focus on damiana-
Turneradiffusa”, J Ethnopharmacol, 152(3): 424-43.
39. Zhang HJ, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Hung NV, Cuong NM, Soejarto Đ, Pezzuto JM, Fong HH (2003), “New Sesquiterpenes from Litsea verticillata”, J Nat Prod, 66(5): 609-615.
Tài liệu Internet
40.http://www.banbuonduoclieu.com/blog/cao-kho-dong-hau-damiana-extract. 41. http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia/4667.02.633929315971288750. 42. “Phân họ hoa thời chung”, http://vi.wikipedia.org.
43.http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/su-can-thiet-phat-trien- duoc-lieu-354-677.html.
44.“Chi Đông hầu”, https://vi.wikipedia.org.
45. “Turnera ulmifolia (West Indian holly)”, https://www.cabi.org.
47.“Một số cây thuốc nam có tác dụng trị mụn làm đẹp da”, https://www.meo trimuntrungca.com/mot-so-cay-thuoc-nam-co-tac-dung-tri-mun-lam-dep- da.html.
48.Trần Phạm (2016), “Đông hầu là gì”, Hello Health Group, https://hellobac si.com/thao-duoc/dong-hau/, ngày 11/6/2016.
49.http://skinmedicine.vn/cao-cang-da-dong-hau-my-pham-thien-nhien-lam- cang-da-vinh-vien/.