3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Các số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn [9] các giá trị thống kê về giá trị trung bình ( ), sai số trung bình mẫu (mx) với P<0,05, α= 0,05.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu
Muốn có cây non vô trùng, sạch bệnh để tiến hành các thí nghiệm sau này. Hạt hay các bộ phận của cây phải được khử trùng trước khi đưa vào bình nuôi cấy. Trước khi khử trùng, hạt được chọn lọc cẩn thận, loại bỏ lớp vỏ lụa bên ngoài. Sau đó, khử trùng hạt theo các công thức. Sau mỗi lần ngâm hóa chất, hạt được rửa sạch bằng nước cất đã khử trùng 3 đến 5 lần. Mọi thao tác được thực hiện trong box cấy vô trùng. Sau khi được khử trùng, hạt được gieo trên môi trường đã chuẩn bị. Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây Đông hầu vàng Công thức Thời gian xử lý (phút) Tỷ lệ hạt nhiễm (%) Tỷ lệ hạt không nhiễm nảy mầm (%) Cồn 70o Javen 70% HgCl2 0,1% Clo KT1 1 20 0 0 0 40,00 ± 1,93 KT2 1 20 5 0 0 33,33 ± 1,92 KT3 0 0 0 240 2,22 35,67 ± 2,67 KT4 0 0 0 300 0 38,89 ± 2,25 KT5 0 0 0 360 0 27,56 ± 1,63
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, hầu hết các công thức khử trùng trên đều cho mẫu sạch bệnh không bị nhiễm khuẩn, mốc. Các công thức KT1, KT2, KT4, KT5 đều đạt yêu cầu. Hạt được khử trùng theo công thức KT1 có tỷ lệ hạt nảy mầm (40,00%) cao hơn hạt được khử trùng theo các công thức còn lại. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được khử trùng theo công thức KT2 (33,33%) thấp hơn công thức KT1 có thể do thủy ngân clorua là chất kim loại nặng độc, ảnh hưởng đến mẫu nuôi cấy.
Hạt Đông hầu vàng có kích thước nhỏ, việc khử trùng bằng dung dịch (công thức KT1, KT2) gặp khó khăn, dễ bị mất hạt trong quá trình khử trùng. Do đó, phương pháp khử trùng bằng khí Clo được lựa chọn để nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm khử trùng hạt bằng khí Clo trong các khoảng thời gian 4, 5 và 6 giờ cho thấy, tỷ lệ nhiễm của hạt giảm khi thời gian khử trùng tăng lên. Khử trùng hạt bằng khí Clo trong 5 giờ cho hiệu quả khử trùng và tỷ lệ hạt không nhiễm nảy mầm là 38,89% thấp hơn công thức KT1, nhưng không đáng kể. Với thời gian khử trùng là 6 giờ, các hạt không bị nhiễm, tỷ lệ hạt nảy mầm (27,56%) thấp hơn so với hạt được khử trùng trong 5 giờ, đồng thời tốn thời gian khử trùng hơn. Như vậy trong các công thức khử trùng thì phương pháp khử trùng hạt bằng khí Clo trong khoảng thời gian 5 giờ là thích hợp nhất, tạo nguồn nguyên liệu sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng
3.2. Nghiên cứu môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm
Từ kết quả thí nghiệm nghiên cứu công thức khử trùng hạt cho thấy: hạt Đông hầu vàng khi được cấy trong môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l có tỷ lệ hạt nảy mầm thấp (38,89%). Một số chất kích thích sinh trưởng như BAP hay GA3 có khả năng phá ngủ, kích thích sự nảy mầm của hạt. Do đó các chất kích thích sinh trưởng này được sử dụng với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nảy mầm của hạt Đông hầu vàng. Thí nghiệm gồm 4 công thức và được thực hiện lặp lại 3 lần. Sau 4 tuần thu được kết quả trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 cho thấy, trong môi trường có GA3, tỷ lệ hạt nảy mầm trong CT3 và CT4 lần lượt là 43,33 và 40%, chênh lệch không nhiều so với tỷ lệ hạt nảy mầm trong môi trường đối chứng (môi trường không có chất kích thích sinh trưởng). Như vậy, GA3 ở nồng độ 0,5 – 1 mg/l không có tác dụng phá ngủ và kích thích nảy mầm đối với hạt Đông hầu vàng. Trong môi trường bổ sung BAP, tỷ lệ hạt nảy mầm trong CT1 và CT2 lần lượt là 75,56% và 64,44% cao hơn so với môi trường đối chứng (38,89%) và môi trường bổ sung GA3 (40- 43,33%). Như vậy, BAP có tác dụng kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm và công thức CT1 cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (75,56%) được chọn làm môi trường kích thích hạt nảy mầm để tạo nguồn nguyên liệu in vitro cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Đông hầu vàng ở các môi trường Công thức
Nồng độ chất kích thích
sinh trưởng nảy mầm Tỷ lệ hạt (%) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ GA3 (mg/l) ĐC 0 0 38,89 ± 2,25 CT1 0,5 0 75,56 ± 4,84 CT2 1,0 0 64,44 ± 4,84 CT3 0 0,5 43,33 ± 1,93 CT4 0 1,0 40,00 ± 1,93
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng Đông hầu vàng
Trước khi nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng, các môi trường MS cơ bản có bổ sung chất phụ gia (bao gồm nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết khoai tây, dịch chiết cà chua và than hoạt tính) được khảo sát. Kết quả theo dõi ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng sau 8 tuần được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng Công thức Nồng độ chất phụ gia (ml/l)
Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,65 ± 0,10 +++ Nước dừa CT1 50 1,13 ± 0,12 1,52 ± 0,21 ++ CT2 100 1,20 ± 0,16 1,60 ± 0,19 ++ CT3 150 1,07 ± 0,04 1,51 ± 0,13 ++ CT4 200 1,13 ± 0,13 1,44 ± 0,03 ++ Dịch chiết chuối CT1 50 1,17 ± 0,14 1,23 ± 0,21 + CT2 100 1,10 ± 0,15 1,14 ± 0,22 + CT3 150 1,17 ± 0,04 1,10 ± 0,11 + CT4 200 1,20 ± 0,12 1,20 ± 0,03 +
Dịch chiết khoai tây
CT1 50 1,23 ± 0,13 1,27 ± 0,13 + CT2 100 1,15 ± 0,15 1,34 ± 0,11 + CT3 150 1,27 ± 0,14 1,37 ± 0,12 + CT4 200 1,15 ± 0,04 1,33 ± 0,05 + Dịch chiết cà chua CT1 50 1,10 ± 0,18 1,34 ± 0,23 + CT2 100 1,17 ± 0, 16 1,28 ± 0,08 + CT3 150 1,22 ± 0,07 1,45 ± 0,11 + CT4 200 1,13 ± 0,12 1,24 ± 0,19 + Than hoạt tính CT1 0,5 g/l 1,00 ± 0,00 1,47 ± 0,21 ++ CT2 1,0 g/l 1,00 ± 0,00 1,52 ± 0,10 ++ CT3 1,5 g/l 1,00 ± 0,00 1,65 ± 0,10 ++ CT4 2,0 g/l 1,00 ± 0,00 1,39 ± 0,14 ++
Ghi chú: (+): chồi yếu, lá to, màu xanh nhạt; (++): chồi khỏe, lá nhỏ, màu xanh nhạt; (+++): chồi khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ các chất phụ gia khác nhau thì khả năng phát sinh chồi có sự khác nhau, chứng tỏ các chất phụ gia có ảnh hưởng đến sự hình thành chồi của cây Đông hầu vàng. Trong các loại dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì dịch chiết khoai tây có nồng độ 150 ml/l cho số chồi/mẫu cao nhất (1,27 chồi/mẫu). Tuy nhiên, chiều cao chồi của mẫu cấy trong môi trường này thấp hơn so với mẫu cấy trong môi trường có bổ sung than hoạt tính 1,5 g/l và môi trường đối chứng. Trong các môi trường có bổ sung nước dừa, nồng độ nước dừa càng cao thì chất lượng chồi càng kém, có hiện tượng xoăn lá và chồi yếu. Trong môi trường có bổ sung các loại dịch chiết khác, mẫu cấy cho chồi yếu, lá vàng úa và có hiện tượng “thủy tinh hóa”. Xét về chất lượng chồi thì môi trường đối chứng cho chất lượng chồi tốt nhất, chồi khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa 100 ml/l và than hoạt tính 1,5 g/l đến sự
sinh trưởng của cây Đông hầu vàng
Như vậy, các chất phụ gia như nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết khoai tây, dịch chiết cà chua và than hoạt tính có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của cây Đông hầu vàng tuy nhiên mức ảnh hưởng chưa lớn. Qua thí nghiệm trên môi trường đối chứng là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng, phát triển của cây Đông hầu vàng.
3.4. Nghiên cứu tạo đa chồi cây Đông hầu vàng
Trong môi trường nuôi cấy in vitro, bên cạnh các chất đa lượng, vi lượng, vitamin còn bổ sung nhiều loại kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin, gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan cung cấp dinh dưỡng cho mẫu phát triển. Tuy nhiên yêu cầu với những chất này thay đổi tùy theo loài cây, loại mô, mục đích nghiên cứu. Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng phù hợp cho từng loại cây, từng giai đoạn phát triển là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng hầu vàng
BAP (6-benzyl Amino Purin) là hoocmon thuộc nhóm cytokinin. Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của adenin, có ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò quan trọng trong tạo đa chồi của mẫu nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi của cây Đông hầu vàng sau 2, 4, 6 và 8 tuần được thể hiện trong bảng 3.4 (với P<0,05, α= 0,05) và hình 3.3.
Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%, chất lượng chồi tốt, chồi khỏe, mập và phát triển cân đối. Ở công thức môi trường đối chứng, sau 2, 4, 6 và 8 tuần, số chồi/mẫu chỉ đạt 1,00 chồi. Sau 2 tuần, môi trường CT1, CT3, CT4, CT5 cho số chồi/mẫu trung bình lần lượt là 1,14; 1,14; 1,14; 1,18 chồi, cao hơn so với công thức đối chứng. Môi trường CT2 cho số chồi/mẫu là 1,36 chồi, cao hơn môi trường đối chứng và các công thức môi trường khác. Sau 4, 6 và 8 tuần, công thức môi trường CT2 vẫn là công thức môi trường cho số chồi/mẫu cao nhất trong các công thức môi trường. Sau 8 tuần, công thức môi trường CT2 cho số chồi/mẫu là 1,46 chồi, trong khi đó, các công thức môi trường CT1, CT3, CT4, CT5 cho số chồi/mẫu lần lượt là 1,25; 1,29; 1,29; 1,29 chồi.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng
Công thức Nồng độ
BAP (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Sau 2 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 0,52 ± 0,05 CT1 0,5 1,14 ± 0,07 0,61 ± 0,05 CT2 1,0 1,36 ± 0,11 0,74 ± 0,09 CT3 1,5 1,14 ± 0,07 0,82 ± 0,09 CT4 2,0 1,14 ± 0,07 0,89 ± 0,08 CT5 2,5 1,18 ± 0,07 0,83 ± 0,09 Sau 4 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,04 ± 0,07 CT1 0,5 1,18 ± 0,07 0,97 ± 0,08 CT2 1,0 1,46 ± 0,12 1,26 ± 0,14 CT3 1,5 1,14 ± 0,07 1,29 ± 0,14 CT4 2,0 1,25 ± 0,10 1,35 ± 0,12 CT5 2,5 1,29 ± 0,10 1,24 ± 0,13 Sau 6 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,36 ± 0,08 CT1 0,5 1,21 ± 0,08 1,19 ± 0,10 CT2 1,0 1,46 ± 0,12 1,69 ± 0,18 CT3 1,5 1,29 ± 0,09 1,53 ± 0,17 CT4 2,0 1,29 ± 0,11 1,75 ± 0,15 CT5 2,5 1,29 ± 0,10 1,61 ± 0,16 Sau 8 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,65 ± 0,10 CT1 0,5 1,25 ± 0,08 1,39 ± 0,12 CT2 1,0 1,46 ± 0,12 1,98 ± 0,20 CT3 1,5 1,29 ± 0,09 1,85 ± 0,20 CT4 2,0 1,29 ± 0,11 2,18 ± 0,19 CT5 2,5 1,29 ± 0,10 2,27 ± 0,27
Hình 3.3. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 sau 4 tuần
Theo Kalimuthu và Preeetha, nồng độ thích hợp cho sự hình thành đa chồi là BAP 2,22µM [27]. Vậy trong thí nghiệm này, môi trường thích hợp tạo đa chồi là CT2 (môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l). Từ thí nghiệm trên ta thấy, tỷ lệ tạo đa chồi cây Đông hầu vàng khi sử dụng chất kích thích sinh trưởng là BAP chưa cao.
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng Đông hầu vàng
Tương tự như BAP, kinetin cũng là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, có khả năng kích thích tạo đa chồi và được sử dụng phổ biến. Cắt thân cây Đông hầu vàng thành các đoạn có một nách lá mầm có kích thước từ 1-1,5cm. Cắt bỏ lá, đem cấy vào môi trường MS có bổ sung kinetin ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Theo dõi sự sinh trưởng và khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5, hình 3.4.
Sau 4 tuần Sau 8 tuần
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng
Công thức Nồng độ
kinetin (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Sau 2 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 0,52 ± 0,05 CT1 0,5 1,39 ± 0,11 0,78 ± 0,07 CT2 1,0 1,36 ± 0,12 0,73 ± 0,05 CT3 1,5 1,43 ± 0,12 0,87 ± 0,09 CT4 2,0 1,07 ± 0,05 0,66 ± 0,06 CT5 2,5 1,32 ± 0,10 0,58 ± 0,06 Sau 4 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,04 ± 0,07 CT1 0,5 1,39 ± 0,11 1,16 ± 0,10 CT2 1,0 1,36 ± 0,12 1,19 ± 0,09 CT3 1,5 1,50 ± 0,12 1,20 ± 0,11 CT4 2,0 1,25 ± 0,10 0,92 ± 0,09 CT5 2,5 1,36 ± 0,11 0,92 ± 0,09 Sau 6 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,36 ± 0,08 CT1 0,5 1,50 ± 0,11 1,41 ± 0,13 CT2 1,0 1,39 ± 0,12 1,52 ± 0,12 CT3 1,5 1,54 ± 0,12 1,53 ± 0,13 CT4 2,0 1,32 ± 0,12 1,38 ± 0,12 CT5 2,5 1,36 ± 0,11 1,30 ± 0,13 Sau 8 tuần ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,65 ± 0,10 CT1 0,5 1,5 ± 0,11 1,78 ± 0,16 CT2 1,0 1,39 ± 0,12 1,87 ± 0,15 CT3 1,5 1,54 ± 0,12 1,90 ± 0,16 CT4 2,0 1,32 ± 0,12 1,79 ± 0,15 CT5 2,5 1,36 ± 0,01 1,77 ± 0,17
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%, chất lượng chồi tốt, khỏe, mập và phát triển cân đối. Sau 8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu thu được lần lượt trên các môi trường CT1, CT2, CT4, CT5 là 1,5; 1,39; 1,32 và 1,36 chồi. Riêng môi trường CT3 cho số chồi/mẫu cao nhất (1,54 chồi) và chiều cao chồi cao nhất (1,90cm). Do đó, công thức môi trường thích hợp nhất tạo đa chồi cây Đông hầu vàng ở thí nghiệm này là CT3 (môi trường MS bổ sung kinetin 1,5 mg/l).
Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP và kinetin) cho thấy, môi trường thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi cây Đông hầu vàng là MS cơ bản bổ sung BAP 1,0 mg/l hoặc kinetin 1,5 mg/l. Sau 8 tuần, môi trường sử dụng BAP 1,0 mg/l cho số chồi/mẫu là 1,46 chồi và chiều cao chồi là 1,98 cm, môi trường sử dụng kinetin 1,5 mg/l cho số chồi/mẫu đạt 1,54 chồi, cao hơn so với môi trường có BAP 1,0 mg/l, tuy nhiên sự chênh lệch này không lớn. Xét BAP có giá thành bằng ¼ so với kinetin và lượng BAP cần sử dụng ít hơn kinetin nên môi trường thích hợp cho sự phát sinh chồi cây Đông hầu vàng là môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l.
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng sinh chồi cây Đông hầu vàng
Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của từng loại chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) cho thấy, sự phát sinh chồi cây Đông hầu vàng trong các môi trường này còn thấp. Để tăng số chồi/mẫu, ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin tiếp tục được nghiên cứu, cụ thể là ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA