3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Một số kỹ thuật phân tử nhƣ PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) đƣợc phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của HPV-DNA trong tế bào cổ tử cung. Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác định đƣợc các types và phân biệt các thƣơng tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV. Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09 - MY11 (Bauer & cs, 1991) [13] và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990) [20]. Các hệ primer này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gene L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều types HPV trong bệnh phẩm. Nhằm xác định chính xác các types HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều công trình sử dụng phối hợp các bộ mồi consensus và mồi đặc hiệu type trong phản ứng nested PCR (Harwood & cs, 1999) [18] hoặc phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn (Nelson & cs, 2000) [26]. Hybrid Capture Test (Digen Corporation), đã đƣợc thƣơng mại hóa ở Hoa Kỳ, là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với HPV-DNA phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang. Nhiều công trình khác định type bằng cách sử dụng phối hợp PCR với lai phân tử, trong đó sản phẩm PCR consensus đƣợc lai với các probe đặc hiệu cho type đƣợc cố định trên giá thể rắn, kiểu lai có tên là reverse blotting (Ylitalo & cs, 1995 [35]; Gravitt & cs, (2000) [16]). Những công trình sau đó so sánh hiệu quả phát hiện và định type của các
phƣơng pháp đã đƣợc công bố cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có nhiều ƣu điểm nhất (Vernon & cs, 2000 [34]; Van Den Brule & cs, 2002 [33]). Gần đây đã xuất hiện các công trình không những chỉ phát hiện và định type mà còn định lƣợng virus có trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Hart & cs, 2001) [17]. Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng nhiều nhất với các bộ mồi đƣợc chọn vùng gen bảo tồn cao giữa các types (E1 và L1) (Karlsen & cs, 1996 [24]; Gravitt & cs, 2000 [16]). Để xác định các types HPV, Harwood & cs, 1999 dùng phản ứng nested PCR [18]; Nelson & cs 2000 phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn [26]. Tháng 4/2002 Hiệp hội Soi cổ tử cung và Bệnh học cổ tử cung của Mỹ (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) đã đƣa ra hƣớng dẫn lâm sàng khuyến cáo thử HPV-DNA cho những phụ nữ có kết quả Pap test không xác định. Các tác giả Hàn quốc (Lee và Seo 2002 [25]) tầm soát ung thƣ cổ tử cung theo 3 giai đoạn: Tầm soát ban đầu, trong quản lý bệnh nhân có tế bào học bất thƣờng ở mức độ thấp, và trong theo dõi sau điều trị những tổn thƣơng tiền ung thƣ nêu ra thử nghiệm HPV-DNA có độ nhạy cao hơn tế bào học kinh điển bởi vì nó đánh giá chính tình trạng nhiễm HPV.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các tác giả Việt Nam nhƣ Trịnh Quang Diện & Nguyễn Vƣợng, Nguyễn Ngọc Hiếu & Trần Ngọc Kính, Nguyễn Bá Đức & cs, Nguyễn thị Nhƣ Ngọc & cs… hầu hết chỉ sử dụng phƣơng pháp tế bào học để phát hiện sớm ung thƣ cổ tử cung hay chẩn đoán nhiễm HPV qua hình ảnh tế bào học [1], [3], [4], [5], [7], [8]. Bên cạnh đó đã có thêm một số nghiên cứu với phƣơng pháp sinh học phân tử: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán một số bệnh thƣờng gặp ở Việt Nam” (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng & cs, 2004) [2], “Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán” (Thái Kế Quân & cs, 2004) [11], “Human papillomavirus infection among women in South and North Vietnam” (Pham Thi Hoang Anh & cs, 2003) [28]. Một nghiên cứu phối hợp của Nguyễn Trọng Hiếu & Cs với WHO năm 2002 bằng test HPV-DNA [6], cho thấy tỉ lệ nhiễm HPV ở một quận nội thành ở thành phố Hồ Chí Minh là 10,9% và 2% ở
Hà Nội. HPV đƣợc tìm thấy nhiều nhất ở phụ nữ dƣới 25 tuổi ở TP.Hồ Chí Minh (22,3%). Nghiên cứu của Phạm Việt Thanh về tỷ lệ nhiễm HPV ở 408 trƣờng hợp có tổn thƣơng tế bào HSIL và ung thƣ cổ tử cung là 93,14% trong đó nhiễm nhóm nguy cơ cao là 95% và nhóm nguy cơ thấp là 5% [12]. Nghiên cứu của Vũ Thị Nhung về tỷ lệ nhiễm HPV ở 50 trƣờng hợp có tổn thƣơng tế bào từ LSIL (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion là tổn thƣơng trong biểu mô lát mức độ thấp) đến HSIL (High grade Squamous Intraepithelial Lesion là tổn thƣơng trong biểu mô lát mức độ cao) và ung thƣ cổ tử cung là 76%. Tỷ lệ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao có cao hơn nhóm nguy cơ thấp (52,64% / 47,36%) [9]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004) cho kết luận khả năng HPV lây nhiễm từ mẹ sang con trong bệnh u nhú thanh quản lúc sinh ngả âm đạo [1]. Một số bộ kit xây dựng trong nƣớc cho phép phát hiện sự hiện diện của HPV trong mẫu bệnh phẩm của một số công ty (Nam Khoa, Khoa Thƣơng - Tp.HCM) cũng đang đƣợc sử dụng tại các cơ sở y tế tại Tp.HCM. Các bộ kit này chủ yếu dựa trên kỹ thuật PCR hoặc PCR-ELISA với nhƣợc điểm là giá cả khá cao và số lƣợng type phát hiện có giới hạn. Nhƣ vậy, một quy trình phát hiện và định type HPV tiện dụng và có giá rẻ hơn so với những kit đang sử dụng sẽ có ý nghĩa cho công tác theo dõi và điều trị. Nghiên cứu Vũ Thị Nhung xác định tỷ lệ nhiễm HPV phát hiện bằng phƣơng pháp PCR là 12%, trong đó 77,78% nhiễm type HPV nguy cơ cao và 66,67% các tổn thƣơng tiền ung thƣ dƣơng tính với HPV [10]. Trần Thị Lợi ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ TPHCM là 10,84%. Tại Cần Thơ, tỷ lệ nhiễm HPV ở quận Ninh Kiều là 9,5%. Theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, Nguyễn Hoàng Chƣơng và Nguyễn Thị Vân Anh năm 2003 tại bệnh viện Hùng Vƣơng, Thành phố Hồ Chí Minh có 38/50 bệnh nhân nhiễm HPV chiếm 76% trong đó các types HPV phổ biến nhất là 11, 16. Năm 2004 Lê Thị Kiều Dung đã nghiên cứu đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ là 80%. Theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung năm 2006 tại Thành phố Hồ Chí Minh thì tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng là 11,86%, các types HPV phổ biến nhất là 18, 58, 16. Năm 2007 Phạm Hùng Vân đã phát triển phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gene L1 để
nhờ đó xác định kiểu gene của HPV. Năm 2008 Nguyễn Thị Tuyết Ngân nghiên cứu 472 phụ nữ trong độ tuổi sinh sản tại Huyện Cƣ Mgar, Tỉnh Đắk Lắk đƣa ra kết quả tỷ lệ nhiễm HPV là 7,6%, các types HPV phát hiện là 16, 18, 58, 81, 45. Theo nghiên cứu của Lan Vũ năm 2012 trên 4.500 phụ nữ đã lập gia đình ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Huế, Cần Thơ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở các khu vực lần lƣợt là: 6,13%, 8,27%, 9,2%, 8,6% và 10,2%.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
* Phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ đến khám phụ khoa có biểu hiện viêm cổ tử cung. - Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên cứu:
+ Phụ nữ tuổi từ 18-60, đã có quan hệ tình dục. + Chƣa đƣợc tiêm vacxin phòng HPV.
+ Tại thời điểm khám phụ khoa không có thai, không trong thời kỳ hành kinh. + Không rửa sâu vào âm đạo trƣớc khi xét nghiệm.
+ Không điều trị bệnh phụ khoa ít nhất 7 ngày trƣớc khi đƣợc khám.
+ Có tổn thƣơng viêm cổ tử cung (mất biểu mô lát tầng nhẵn bóng, nốt sùi, vết loét, viêm lộ tuyến).
- Mẫu bệnh phẩm là dịch phết cổ tử cung của phụ nữ đến khám phụ khoa có đủ tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu.
* Các type HPV
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
STT Dung dịch Thành phần, nồng độ 1 Đệm TAE 242g Tris – Base 57,1 ml CH3COOH 100 ml 0,5 EDTA H2O vừa đủ 1000 ml pH = 8,5
2 Dung dịch nhuộm gel 0.1 µg/ml ethidium bromide
3 Loading dye
0,25 % bromophenol blue 40% sucrose
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị Hãng sản xuất ( nƣớc)
1 Tủ an toàn sinh học cấp II ESCO, Singapore
2 Cân điện tử Sartorious, Đức
3 Lò vi sóng Sharp – Malaysia
4 Nồi khử trùng ƣớt Tomy, Nhật Bản
5 Máy li tâm lạnh Eppendorf, Đức
6 Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, Đức
7 Máy Realtime-PCR Eppendorf, Đức
8 Hệ thống chụp ảnh điện di BioDoc-ItTM, Mỹ
9 Thiết bị điện di BIORAD, Mỹ
10 Buồng thao tác PCR ESCO, Singapore
11 Tủ lạnh -200C Frigor, Đan Mạch
12 Pipet, đầu côn các loại, ống
eppendorf các loại …. Trung Quốc, Đức, Việt Nam - Hóa chất tách chiết DNA:
Dung dịch trizol pH 8: Trizol, phenol, guanidium thiocyanate, Natri citrate. Dung dịch TE 1X: Tris-HCl, EDTA.
- Bộ kit Realtime-PCR định tính HPV (phát hiện HPV-DNA):
iVA
HPV rPCR Mix
- Bộ kit định kiểu gene Human Papilloma Virus (HPV):
iVA
HPV Genotype rPCR-RDB Mix
Nguồn cung cấp: Cty Cổ phần Cổ phần công nghệ Việt Á (Tiêu chuẩn ISO 9001:2008 và GMP-WHO).
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
* Thời gian: Từ tháng 3/2014 đến tháng 3/2015.
* Địa điểm nghiên cứu:
- Phòng xét nghiệm Vi sinh-Sinh học phân tử, Trƣờng Đại học Y-Dƣợc, Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm
2.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Mẫu sử dụng là dịch phết cổ tử cung, đƣợc cung cấp từ Phòng khám Sản phụ khoa, Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên. Tăm bông vô trùng sau khi thu nhận mẫu đƣợc hòa trong dung dịch 0,5 ml dung dịch TE 1X trong ống eppendorf 1,5ml, giữ lạnh, chuyển nhanh về Phòng xét nghiệm. Vortex để các virus rời khỏi đầu tăm bông và hoà vào dung dịch.
- Bảo quản mẫu ở -200C đến khi tiến hành tách chiết DNA.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn
Mẫu dịch phết CTC
Tách chiết DNA
Thực hiện
Realtime-PCR HPV-DNA (-)
HPV-DNA (+)
Lai Reverse Dot Blot
(protein, màng tế bào…). DNA sẽ đƣợc tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Cặn DNA đƣợc huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -200C.
* Tiến hành:
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch trizol pH8, vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200l dung dịch chloroform, trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu 600l dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng có sẵn 600l dung dịch isopropanol. Trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900l dung dịch ethanol 70% vào. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn màu xanh). Để khô ở 600C trong 3-5 phút. Hòa DNA với 50l dung dịch TE 1X.
- Bảo quản mẫu DNA đã tách chiết ở -200C tới khi thí nghiệm.
- Dùng 5l mẫu DNA đã tách chiết chạy phản ứng Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA.
Tất các các lƣợt tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm luôn có chứng âm và chứng dƣơng đƣợc tách cùng.
2.3.3. Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA
Nguyên tắc phản ứng PCR: Dựa vào hoạt động của enzyme Tag Polymerase,
enzyme này kéo dài mạch mới dựa trên trình tự khuôn với sự hiện diện của mồi và các nucleotide tự do ở điều kiện và nhiệt độ phòng thích hợp
Thành phần phản ứng PCR:Một phản ứng Realtime-PCR thể tích 25µl
Mẫu xét nghiệm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl DNA tách chiết. Chứng dƣơng: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng dƣơng. Chứng âm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng âm.
Chương trình Realtime-PCR: 1 chu kỳ: 950C/5 phút; 40 chu kỳ: 950
C/15 giây, 550
C/1 phút (chọn đọc kết quả tại bƣớc này), 720
Phân tích kết quả:
Sau khi kết thúc quá trình Realtime PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết quả. Phân tích đồ thị ở dạng “Linear” và dạng “Log”.
Phân tích chứng dƣơng và âm: Chỉ chọn giếng chứng dƣơng và âm, chọn màu FAM rồi đến màu JOE. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bƣớc phân tích kết quả nếu: Chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính hoặc thẳng và không vƣợt qua tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn âm tính), chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Chọn từng mẫu và phân tích đồ thị ở chế độ dữ liệu chế độ thô. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trƣớc, kết luận “Mẫu dƣơng tính”. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng phát hiện”. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đƣờng biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus trong mẫu”. Những mẫu dƣơng tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dƣơng hoặc âm. Những mẫu âm tính, chứng nội phải dƣơng tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm, chứng nội và mẫu cần in đồ thị. Copy đồ
thị vào trang trả kết quả, chú thích các đƣờng biểu diễn diễn “Chứng âm”, “Chứng nội” “Mẫu”.
Sản phẩm PCR dƣơng tính, kể cả dƣơng tính dƣới ngƣỡng đƣợc sử dụng trực tiếp cho định kiểu gene với kit VA.A02-003J. Nếu chƣa sử dụng ngay đƣợc bảo quản ở -200C.
2.3.4. Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB)
Nguyên tắc: Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu
đem lai với sản phẩm PCR đánh dấu biotin đã đƣợc biến tính. Phản ứng lai xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt độ thích hợp. Phân tử lai đƣợc phát hiện nhờ phản ứng hiện màu giữa Streptavidin-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP.
Một số dung dịch dùng cho RDB:
Dung dịch DB1, DB2, DB3, DB4, DB5 và DB6 (bộ kít thƣơng mại)
Lai và phát hiệntype HPV:
- Trộn đều các dung dịch trƣớc khi sử dụng. Đánh dấu các hộp chứa màng lai bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 50µl dung dịch DB1 vào tube 0,2ml chứa sẵn sản phẩm PCR, trộn đều thật kỹ bằng pipette hoặc vortex, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Cho 100µl dung dịch DB6 vào tube 0,2ml chứa dung dịch DB4, trộn đều rồi cho tất cả cùng với sản phẩm PCR trong dung dịch DB1 ở trên vào mỗi hộp nhỏ chứa màng lại đã cho sẵn 1,8ml dung dịch DB6, trộn đều, lắc ủ 3-4h ở 400C, lắc ở tốc độ vừa phải để dung dịch không tràn ra ngoài.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài. Cho vào 5ml dung dịch DB6, lắc rửa 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 30 giây.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài. Cho vào 1,5ml dung dịch DB5, ủ 15-45 phút ở 370
C trong điều kiện tối, không đƣợc