3. Nội dung nghiên cứu
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm
2.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Mẫu sử dụng là dịch phết cổ tử cung, đƣợc cung cấp từ Phòng khám Sản phụ khoa, Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên. Tăm bông vô trùng sau khi thu nhận mẫu đƣợc hòa trong dung dịch 0,5 ml dung dịch TE 1X trong ống eppendorf 1,5ml, giữ lạnh, chuyển nhanh về Phòng xét nghiệm. Vortex để các virus rời khỏi đầu tăm bông và hoà vào dung dịch.
- Bảo quản mẫu ở -200C đến khi tiến hành tách chiết DNA.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn
Mẫu dịch phết CTC
Tách chiết DNA
Thực hiện
Realtime-PCR HPV-DNA (-)
HPV-DNA (+)
Lai Reverse Dot Blot
(protein, màng tế bào…). DNA sẽ đƣợc tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Cặn DNA đƣợc huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -200C.
* Tiến hành:
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch trizol pH8, vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200l dung dịch chloroform, trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu 600l dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng có sẵn 600l dung dịch isopropanol. Trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900l dung dịch ethanol 70% vào. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn màu xanh). Để khô ở 600C trong 3-5 phút. Hòa DNA với 50l dung dịch TE 1X.
- Bảo quản mẫu DNA đã tách chiết ở -200C tới khi thí nghiệm.
- Dùng 5l mẫu DNA đã tách chiết chạy phản ứng Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA.
Tất các các lƣợt tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm luôn có chứng âm và chứng dƣơng đƣợc tách cùng.
2.3.3. Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA
Nguyên tắc phản ứng PCR: Dựa vào hoạt động của enzyme Tag Polymerase,
enzyme này kéo dài mạch mới dựa trên trình tự khuôn với sự hiện diện của mồi và các nucleotide tự do ở điều kiện và nhiệt độ phòng thích hợp
Thành phần phản ứng PCR:Một phản ứng Realtime-PCR thể tích 25µl
Mẫu xét nghiệm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl DNA tách chiết. Chứng dƣơng: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng dƣơng. Chứng âm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng âm.
Chương trình Realtime-PCR: 1 chu kỳ: 950C/5 phút; 40 chu kỳ: 950
C/15 giây, 550
C/1 phút (chọn đọc kết quả tại bƣớc này), 720
Phân tích kết quả:
Sau khi kết thúc quá trình Realtime PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết quả. Phân tích đồ thị ở dạng “Linear” và dạng “Log”.
Phân tích chứng dƣơng và âm: Chỉ chọn giếng chứng dƣơng và âm, chọn màu FAM rồi đến màu JOE. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bƣớc phân tích kết quả nếu: Chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính hoặc thẳng và không vƣợt qua tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn âm tính), chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Chọn từng mẫu và phân tích đồ thị ở chế độ dữ liệu chế độ thô. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trƣớc, kết luận “Mẫu dƣơng tính”. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng phát hiện”. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đƣờng biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus trong mẫu”. Những mẫu dƣơng tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dƣơng hoặc âm. Những mẫu âm tính, chứng nội phải dƣơng tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm, chứng nội và mẫu cần in đồ thị. Copy đồ
thị vào trang trả kết quả, chú thích các đƣờng biểu diễn diễn “Chứng âm”, “Chứng nội” “Mẫu”.
Sản phẩm PCR dƣơng tính, kể cả dƣơng tính dƣới ngƣỡng đƣợc sử dụng trực tiếp cho định kiểu gene với kit VA.A02-003J. Nếu chƣa sử dụng ngay đƣợc bảo quản ở -200C.
2.3.4. Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB)
Nguyên tắc: Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu
đem lai với sản phẩm PCR đánh dấu biotin đã đƣợc biến tính. Phản ứng lai xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt độ thích hợp. Phân tử lai đƣợc phát hiện nhờ phản ứng hiện màu giữa Streptavidin-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP.
Một số dung dịch dùng cho RDB:
Dung dịch DB1, DB2, DB3, DB4, DB5 và DB6 (bộ kít thƣơng mại)
Lai và phát hiệntype HPV:
- Trộn đều các dung dịch trƣớc khi sử dụng. Đánh dấu các hộp chứa màng lai bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 50µl dung dịch DB1 vào tube 0,2ml chứa sẵn sản phẩm PCR, trộn đều thật kỹ bằng pipette hoặc vortex, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Cho 100µl dung dịch DB6 vào tube 0,2ml chứa dung dịch DB4, trộn đều rồi cho tất cả cùng với sản phẩm PCR trong dung dịch DB1 ở trên vào mỗi hộp nhỏ chứa màng lại đã cho sẵn 1,8ml dung dịch DB6, trộn đều, lắc ủ 3-4h ở 400C, lắc ở tốc độ vừa phải để dung dịch không tràn ra ngoài.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài. Cho vào 5ml dung dịch DB6, lắc rửa 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 30 giây.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài. Cho vào 1,5ml dung dịch DB5, ủ 15-45 phút ở 370
C trong điều kiện tối, không đƣợc lắc. Không để đầu tip dùng hút dung dịch DB5 chạm vào hộp hoặc màng lai, nếu lỡ chạm phải, thay đầu tip mới ngay trƣớc khi tiếp tục hút DB5 cho các mẫu tiếp theo.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, lắc rửa màng lai trong 30 giây với 5ml nƣớc cất.
- Loại bỏ hết nƣớc cất, đọc kết quả. Những tín hiệu dƣơng tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp, những tín hiệu dƣơng tính yếu phải lấy màng lai ra khỏi hộp và đƣa lên trƣớc bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất. Tín hiệu tròn, màu xanh xuất hiện tại vị trí nào trên màng lai thì mẫu dƣơng tính tại vị trí đó.
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, phiên bản 2010.
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Việc nghiên cứu chỉ đƣợc tiến hành khi đã có sự đồng ý của Ban lãnh đạo bệnh viện, nơi tiến hành lấy mẫu nghiên cứu.
- Các thông tin thu đƣợc từ bệnh nhân chỉ nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu. - Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích dự phòng, chẩn đoán, điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe cộng đồng.
- Đối tƣợng tự nguyện tham gia nghiên cứu, mọi thông tin cá nhân của đối tƣợng nghiên cứu đƣợc giữ bí mật.
- Trong quá trình nghiên cứu, đối tƣợng có quyền từ bỏ nếu không muốn tiếp tục tham gia vào nghiên cứu.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để sử dụng cho các thí nghiệm kết tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, với lƣợng tối đa, không bị đứt gãy do các tác động cơ học (phân tử bị đứt gãy do nghiền, lắc mạnh) hoặc bị phân hủy bởi các enzyme có trong tế bào và từ môi trƣờng ngoài. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chất tảy rửa mạnh SDS và proteinase K để tiến hành tách chiết DNA tổng số.
Với những phụ nữ có đầy đủ tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu, khi đƣợc khám lâm sàng phụ khoa nếu có hình ảnh tổn thƣơng cổ tử cung (mất biểu mô lát tầng nhẵn bóng, nốt sùi, vết loét, viêm lộ tuyến) đƣợc chỉ định lấy dịch phết cổ tử cung để xử lý, tách chiết DNA, sản phẩm DNA thu nhận sau quá trình tách chiết đã đƣợc sử dụng để phát hiện DNA tổng số của virus HPV (HPV-DNA) bằng kỹ thuật Realtime-PCR (kỹ thuật định tính).
Sản phẩm PCR thuộc vùng gene L1 của HPV đƣợc nhân bản trong phản ứng Realtime-PCR bằng cặp mồi MY11/MY09, đây là một cặp mồi đã đƣợc công nhận và sử dụng rất rộng rãi để phát hiện HPV. Để phát hiện HPV-DNA bằng kỹ thuật Realtime-PCR, trong mỗi lƣợt phản ứng luôn có mẫu chứng dƣơng và chứng âm chạy cùng với các mẫu xét nghiệm. Chứng dƣơng để đảm bảo sự khuếch đại trong phản ứng là đủ nhạy (phản ứng khuếch đại không bị ức chế), chứng âm để đảm bảo quá trình thao tác trong xét nghiệm không bị ngoại nhiễm (loại bỏ hiện tƣợng dƣơng tính giả của các mẫu xét nghiệm). Trong chứng âm còn có chứng nội tại để chứng minh khâu tách chiết DNA từ mẫu thử đạt độ nhạy và loại bỏ hiện tƣợng âm tính giả. Trong các mẫu xét nghiệm đều có chứng nội tại để đảm bảo nếu mẫu âm tính thì là âm tính thực sự chứ không phải là âm tính giả do phản ứng khuếch đại bị ức chế, mẫu xét nghiệm âm tính thực sự khi xuất hiện kết quả dƣơng tính với chứng nội tại.
Hình 3.1. Kết quả phát hiện HPV (HPV-DNA dương tính) bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
Hình 3.1. cho thấy tín hiệu huỳnh quang màu FAM của mẫu xét nghiệm, chứng dƣơng và chứng âm. Với chứng dƣơng và mẫu xét nghiệm cho thấy tín hiệu huỳnh quang tuyến tính của màu FAM đều vƣợt qua đƣờng nền (base line), với chứng âm tín hiệu huỳnh quang màu FAM nằm dƣới đƣờng nền. Khi kết hợp các kết quả tín hiệu huỳnh quang này với tín hiệu huỳnh quanh của các chứng nội tại sẽ cho thấy phản ứng đạt yêu cầu.
* Phân tích chứng dƣơng, chứng âm:
Hình 3.3. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng âm.
Hình 3.2. cho thấy chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính và không vƣợt qua tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn âm tính). Chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính (Hình 3.3.). Kết quả này cho thấy phản ứng khuếch đại đạt yêu cầu.
* Phân tích mẫu xét nghiệm dƣơng tính:
Hình 3.4 cho thấy mẫu xét nghiệm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính). Kết quả này cùng với kết quả phân tích chứng dƣơng và chứng âm cho thấy mẫu xét nghiệm là dƣơng tính thực sự (phát hiện đƣợc HPV-DNA trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân).
Với những mẫu xét nghiệm có chứng nội tại dƣơng tính thì đều đƣợc kết luận mẫu âm tính thật sự (không phát hiện đƣợc HPV-DNA trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân).
* Kết quả phát hiện HPV-DNA và tỷ lệ nhiễm HPV:
Qua tiến hành phản ứng Realtime-PCR với mẫu phết bệnh phẩm cổ tử cung của 166 phụ nữ có hình ảnh tổn thƣơng trên lâm sàng, kết quả cho thấy đã phát hiện đƣợc 47 mẫu cho kết quả HPV-DNA dƣơng tính thực sự. Số mẫu bệnh phẩm còn lại (119) là âm tính. Không có hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả trong các lần thực hiện phản ứng, điều này cho thấy chất lƣợng các phản ứng khuếch đại HPV-DNA đều đảm bảo yêu cầu. Nhƣ vậy tỷ lệ nhiễm HPV trong số phụ nữ khám phụ khoa đƣợc lấy mẫu xét nghiệm phát hiện HPV là 28,31 %. Đã có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm HPV giữa kết quả nghiên cứu của chúng tôi so với kết một nghiên cứu trong nƣớc đã công bố [1], [3], [4], [5], [7], [8]. Sự khác biệt này có thể giải thích do đối tƣợng của các nghiên cứu là không giống nhau nhƣ phụ nữ khám phụ khóa, phụ nữ hành nghề mại dâm, …; có sự khác biệt về thời điểm nghiên cứu, khu vực nghiên cứu và số lƣợng mẫu thu thập của mỗi nghiên cứu.
Tất các sản phẩm PCR dƣơng tính với HPV đều đƣợc sử dụng trực tiếp cho định type HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV
Việc xác định type HPV không dựa vào sự khác biệt trong cấu trúc kháng nguyên của virus (định type huyết thanh) nhƣ việc định type của nhiều virus khác (virus gây viêm gan, HIV…) mà đƣợc dựa trên sự tƣơng đồng HPV-DNA. Đến nay đã có trên 200 types HPV khác nhau đƣợc xác định, trong đó hơn 80 types đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gene và các types còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần. Nhƣ vậy có thể thấy HPV là một trong số virus có nhiều types nhất. Khi một type
HPV có ít nhất 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với những types HPV đã đƣợc xác định thì đƣợc xem là một type HPV mới.
Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm:
Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... Trong đó HPV16 và HPV18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung.
Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6 và HPV11. Các types nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc trên da, sùi mào gà ở vùng hậu môn, sinh dục và các dạng viêm nhiễm khác.
Đã có một số kỹ thuật đƣợc sử dụng để xác định type HPV nhƣ kỹ thuật nested-PCR, phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn, kit Hybrid Capture Test (là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với HPV-DNA phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang) hoặc sử dụng phối hợp kỹ thuật PCR với lai reverse blotting. Nhiều nghiên cứu xác định type HPV cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có nhiều ƣu điểm nhất, chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp này trong việc định type HPV trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho kết quả phát hiện định tính HPV dƣơng tính.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc xác định type HPV dựa trên kỹ thuật Reverse Dot Blot với giá thể là màng lai Biodyn C (Pall coporation). Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu cho các trình tự đích đƣợc cố định trên màng lai thành những điểm. Sản phẩm PCR dƣơng tính đánh dấu biotin đƣợc đem lai với mẫu dò (probes) gắn cố định trên màng lai. Các mẫu dò (probes) đƣợc gắn trên màng lai Biodyn C có trong bộ kit đƣợc tham khảo từ bài báo của nhóm tác giả Van den Brule và cs