3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV
Việc xác định type HPV không dựa vào sự khác biệt trong cấu trúc kháng nguyên của virus (định type huyết thanh) nhƣ việc định type của nhiều virus khác (virus gây viêm gan, HIV…) mà đƣợc dựa trên sự tƣơng đồng HPV-DNA. Đến nay đã có trên 200 types HPV khác nhau đƣợc xác định, trong đó hơn 80 types đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gene và các types còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần. Nhƣ vậy có thể thấy HPV là một trong số virus có nhiều types nhất. Khi một type
HPV có ít nhất 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với những types HPV đã đƣợc xác định thì đƣợc xem là một type HPV mới.
Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm:
Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... Trong đó HPV16 và HPV18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung.
Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6 và HPV11. Các types nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc trên da, sùi mào gà ở vùng hậu môn, sinh dục và các dạng viêm nhiễm khác.
Đã có một số kỹ thuật đƣợc sử dụng để xác định type HPV nhƣ kỹ thuật nested-PCR, phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn, kit Hybrid Capture Test (là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với HPV-DNA phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang) hoặc sử dụng phối hợp kỹ thuật PCR với lai reverse blotting. Nhiều nghiên cứu xác định type HPV cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có nhiều ƣu điểm nhất, chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp này trong việc định type HPV trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho kết quả phát hiện định tính HPV dƣơng tính.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc xác định type HPV dựa trên kỹ thuật Reverse Dot Blot với giá thể là màng lai Biodyn C (Pall coporation). Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu cho các trình tự đích đƣợc cố định trên màng lai thành những điểm. Sản phẩm PCR dƣơng tính đánh dấu biotin đƣợc đem lai với mẫu dò (probes) gắn cố định trên màng lai. Các mẫu dò (probes) đƣợc gắn trên màng lai Biodyn C có trong bộ kit đƣợc tham khảo từ bài báo của nhóm tác giả Van den Brule và cs (2002), chúng nằm trong vùng nhân bản của cặp mồi MY11/MY09. Phản ứng lai xảy ra khi các trình tự oligonucleotide đặc hiệu cho type HPV và mẫu dò gặp nhau do chuyển động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt độ thích hợp. Phân tử lai đƣợc phát hiện nhờ phản ứng hiện màu giữa Streptavidine-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP. Bộ kit
reverse Dot Blot định kiểu gene Human Papilloma Virus (Tên: LightPower iVAHPV Genotype RDB Kit, mã: VA.A02-003J, nguồn: Cty Cổ phần công nghệ Việt Á) cho phép xác định 24 types HPV hiện diện trong mẫu bệnh phẩm, những types virus này bao gồm 8 types virus nhóm nguy cơ thấp là 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81 và 16 type virus thuộc nhóm nguy cơ cao là 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82.
Để định type HPV bằng kỹ thuật lai phân tử, sản phẩm PCR dƣơng tính với HPV từ các phản ứng Realtime-PCR đã đƣợc sử dụng trực tiếp trong các thử nghiệm lai Reverse Dot Bot.
* Phân tích mẫu:
Với những mẫu có tín hiệu dƣơng tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp chứa màng lai, những mẫu có tín hiệu dƣơng tính yếu thì màng lai đƣợc lấy ra khỏi hộp và đƣa lên trƣớc bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất. Tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tƣơng ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm type HPV đó, một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều type virus (vừa có type nhóm nguy cơ thấp vừa có type nhóm nguy cơ cao). Những mẫu âm tính với các types và dƣơng tính tại vị trí chứng dƣơng đƣợc kết luận “Mẫu nhiễm HPV type khác ngoài 24 genotype của bộ kit”.
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí gắn các mẫu dò probes đặc hiệu cho 24 types HPV trên màng lai.
3.2.1. Kiểu type HPV được phát hiện
Với 47 mẫu xét nghiệm dƣơng tính với HPV-DNA, chúng tôi đã xác định đƣợc 5 types HPV (gồm type 6, 11, 81, 16 và 18) trong số 24 types virus có thể xác định bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3.2.2. Sự phân bố của các types HPV được phát hiện Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm các type HPV Nhóm type HPV Type HPV Số lƣợng Tỷ lệ % Nguy cơ thấp 6 12 25,53 11 11 23,4 81 7 14,89
Nguy cơ cao 16 8 19,15
18 9 17,02
Tổng 47 100
Hình 3.6. Biểu đồ phân bố các types HPV
Kết quả bảng 3.1. và hình 3.6. cho thấy có tất cả 5 types HPV đã đƣợc xác định trong số phụ nữ có kết quả xét nghiệm HPV-DNA dƣơng tính. Trong đó nhóm type nguy cơ thấp chiếm đa số 30/47 mẫu (63,83%) gồm ba type 6, 11 và 81 lƣợt lƣợt chiếm tỷ lệ là 25,53%, 23,4% và 14,89%. Nhóm type nguy cơ thấp có 17/47 mẫu (36,17%) gồm hai types thƣờng gặp là type 16 và 18 với tỷ lệ tƣơng ứng là 19,15% và 17,02%.
Nghiên cứu của Võ Huỳnh Kha và Huỳnh Quyết Thắng (2011) trên đối tƣợng là phụ nữ ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV là 92,9%, đã xác định đƣợc 9 types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao ở các
đối tƣợng nghiên cứu, trong đó hay gặp nhất là các type 16, 18 và 58, không có type virus nguy cơ thấp nào đƣợc phát hiện trong những đối tƣợng đƣợc nghiên cứu [13]. Trong nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ phát hiện đƣợc 5 types HPV và tỷ lệ nhiễm các type virus cũng có sự khác biệt. Điều này có thể đƣợc giải thích do nghiên cứu của chúng tôi đƣợc tiến hành trong khoảng thời gian ngắn (khoảng 10 tháng) với số lƣợng mẫu bệnh phẩm thu thập cho xét nghiệm còn ít nên số type HPV đƣợc phát hiện cũng ít hơn. Do đối tƣợng đƣợc lấy mẫu xét nghiệm là phụ nữ đến khám sản phụ khoa và khu vực nghiên cứu có sự khác nhau nên tỷ lệ nhiễm các types HPV ở nhóm đối tƣợng nghiên cứu cũng có sự khác biệt.
3.2.3. Sự đồng nhiễm các type HPV
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các types HPV
Kiểu nhiễm HPV Số lƣợng Tỷ lệ %
Nhiễm 1 type 36 76,6
Nhiễm 2 type 11 23,4
Nhiễm ≥ 3 type 0 0,0
Tổng 47 100
Kết quả bảng 3.2. cho thấy đa số các trƣờng hợp là nhiễm HPV đơn thuần một type (76,6%), chỉ có 23,4% là đồng nhiễm 2 types virus. Không có trƣờng hợp nào đồng nhiễm từ 3 types HPV trở lên.
Bảng 3.3. Tỷ lệ đồng nhiễm các types HPV Đồng nhiễm Các type HPV Số lƣợng Tỷ lệ % Tỷ lệ % đồng nhiễm theo nhóm Nguy cơ thấp-thấp 6-11 2 18,18 90,91 6-81 5 45,45 11-81 3 27,7
Nguy cơ cao-thấp 16-6 1 9,09 9,09
Nguy cơ cao-cao 0 0 0,0
Hình 3.7. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV
Kết quả bảng 3.3 và hình 3.7. cho thấy có sự đồng nhiễm giữa 3 types HPV nhóm nguy cơ thấp (6 và 11, 6 và 81 và 11 và 81) và các kiểu đồng nhiễm này chiếm chủ yếu trong các kiểu đồng nhiễm giữa các types virus (90,91%). Chỉ có 1 trƣờng hợp có kiểu đồng nhiễm giữa nhóm quy thấp và nhóm nguy cơ cao (9,09%). Trong bốn kiểu đồng nhiễm thì kiểu nhiễm phối hợp type 6-81 chiếm đa số (45,45%). Không thấy xuất hiện kiểu nhiễm phối hợp từ 3 types HPV trở lên. Qua kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy hiện tƣợng nhiễm HPV ở phụ nữ không chỉ là nhiễm đơn thuần 1 type virus mà thực tế có thể nhiễm phối hợp 2 types virus, không chỉ đồng nhiễm giữa các types HPV nhóm nguy cơ thấp mà còn có sự đồng nhiễm các type virus giữ nhóm nguy cơ thấp và cao. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc không chỉ cần xét nghiệm sàng lọc tình trạng nhiễm HPV mà còn phải xác định đƣợc cả type HPV để có thể dự phòng, kiểm soát nhiễm virus và theo dõi sự tiến triển của tổn thƣơng ác tính của tế bào biểu mô cổ tử cung trong tầm soát ung thƣ cổ tử cung.
Hình 3.8. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ thấp (type 6, 11 và 81)
Hình 3.9. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ cao (type 16 và 18)
Hình 3.10. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ thấp-thấp
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Phát hiện HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR
47/166 phụ nữ (chiếm 28,31%) nhiễm HPV (HPV-DNA dƣơng tính).
2. Xác định genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot
Trong tổng số 47 trƣờng hợp nhiễm HPV, kết quả xác định type virus cho thấy: - Có 63,83% trƣờng hợp nhiễm HPV nhóm nguy cơ thấp và 36,17% trƣờng hợp nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao.
- Ba types HPV nhóm nguy cơ thấp là type 6 (25,53%), type 11 (23,4%) và type 81 (14,89%) và 2 types HPV nhóm nguy cơ cao là type 16 (19,15%) và type 18 (17,02%) đã đƣợc xác định.
- Tỷ lệ nhiễm HPV đơn thuần (nhiễm một type) là 76,6% và đồng nhiễm (nhiễm 2 types) là 23,4%.
- Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy cơ thấp-thấp gồm: 6-11, 6-81 và 11-81. - Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao-thấp là 16-6.
- Không phát hiện đƣợc sự đồng nhiễm giữa các type HPV nhóm nguy cơ cao. - Không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào đồng nhiễm từ 3 types HPV trở lên.
KHUYẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu thêm sự phân bố của type HPV khác trong cộng đồng. - Với những trƣờng hợp nhiễm các types HPV nhóm nguy cơ cao cần tiến hành xét nghiệm PAP’smear xác định hình thái tế bào biểu mô cổ tử cung nhằm tầm soát, phát hiện các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung góp phần dự phòng và điều trị bệnh sớm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004), “Khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV và con bệnh u nhú thanh quản”, Thời sự Y Dược học, Tháng 8/2004, tr.199-201.
2. Nguyễn Hoàng Chƣơng, Nguyễn Chấn Hùng, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng & cs (2005), “Xây dựng quy trình PCR phát hiện Human Papillomavirus (HPV) trong dịch phết tế bào âm đạo”, Tạp chí Y học Tp. HCM. Tập 9, số 1, tr. 49-53.
3. Trịnh Quang Diện & cs (1999), “Phát hiện sớm các tổn thƣơng biểu mô và ung thƣ cổ tử cung bằng phƣơng pháp tế bào học”, Tạp chí Y học thực hành, số 11, tr. 69-71.
4. Nguyễn Bá Đức & cs (1995), “Nghiên cứu các biện pháp cơ bản phòng ngừa và phát hiện sớm ung thƣ cổ tử cung trong cộng đồng”, Thông tin Y Dược học, Tháng 11/1995, tr.23-27.
5. Nguyễn Ngọc Hiếu & Trần Trọng Kính (1995), “Phát hiện sớm ung thƣ cổ tử cung tại bệnh viện Phụ Sản Hà Nội”, Tạp chí Y học thực hành, số 11, tr. 74-75.
6. Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV ở phụ nữ TP HCM”, Thời sự Y Dược học, Bộ IX số 4, Tháng 8/2004, tr.195-198.
7. Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV ở phụ nữ TP HCM và Hà Nội”, Tạp Chí Phụ sản, Số 1-2, tập 4, Tháng 6/2004, tr.64-72.
8. Nguyễn Thị Nhƣ Ngọc & cs (2002), “Nhận định tình hình tỉ lệ nhiễm HPV qua phết tế bào âm đạo tại bệnh viện Hùng Vƣơng”, Tạp chí Y Học TP.Hồ Chí Minh, số 4, tr.382-386.
9. Vũ Thị Nhung (2004), “Nhận xét bƣớc đầu về liên quan giữa các type HPV và các tổn thƣơng tiền ung thƣ, ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện Hùng Vƣơng”, Nội san Sản Phụ Khoa Số Đặc biệt Bình Dương 14-15/7/2004, tr.170-175.
10. Vũ Thị Nhung & cs (2006), “Khảo sát tình hình nhiễm các types HPV (Human papillomavirus) ở phụ nữ Thành Phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. Đề tài Sở Khoa học và Công Nghệ Tp.HCM.
11. Thái Kế Quân & cs (2004), “Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán”, Chương trình vườn ươm sang tạo Khoa học Kỹ thuật trẻ, Sở Khoa học và Công Nghệ Tp.HCM.
12. Phạm Việt Thanh (2006), “Chƣơng trình tầm soát Human Papilloma Virus (HPV) trong ung thƣ cổ tử cung”, Tạp chí Y học thực hành, số 550, tr.13-24.
13. Võ Văn Kha, Huỳnh Quyết Thắng (2011), “Tỷ lệ nhiễm HPV trên bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ”, Tạp chí Y học T.P. Hồ Chí Minh, tập 15, số 2, tr.168-173.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
14. Baay, M.F.D., Quint, W.G.V., Koudstaal, J., Hollema, H., Duk, J.M., Burger, M.P.M., Stolz, E., & Herbrink, P. (1996), “Comprehensive study of several genral and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas”. J. Clin. Microbiol. 34:745-747.
15. Bauer HM, Ting Y, Greer CE, Chambers JC, Tashiro CJ, Chimera J, Reingold A, Manos MM. JAMA.(1991), “Genital human papillomavirus infection in female university students as determined by a PCR-based method”. Jan 23;265(4):472–477.
16. Gravitt, P.E., Peyton, C.L., Apple, R.J., & Wheeler, C.M. (1998), “Genotyping of 27 human papillomavirus types by using L1 consensus PCR products by a single-hybridization, reverse line blot detection method”. J. Clin. Microbiol. 36:3020-3027.
17. Hart, K.W., Williams, O.M., Thelwell, N., Fiander, A.N., Brown, T., Borysiewicz, L.K., & Gelder, C.M. (2001), “Novel method for detection, typing, and quantification of human papillomaviruses in clinical samples”. J. Clin. Microbiol. 39:3204-3212.
18. Harwood CA, Spink PJ, Surentheran T, Leigh IM, de Villiers EM, McGregor JM, Proby CM, Breuer J (1999), “Degenrate and nested PCR: a highly sensitive and specific method for detection of human papillomavirus infection in cutaneous warts”. J Clin Microbiol. 1999 Nov;37(11):3545-55.
19. IARC HPV prevalence Surveys, 1993-2004.
20. Jacobs, M.V., Snijders, P.J.F., Van den Brule, A.J.C., Helmerhorst, T.J.M., Meijer, C.J.L.M. & Walboomers, J.M.M. (1997), “A genral primer GP5+/GP6+- mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings”. J. Clin.Microbiol. 35:791-795.
21. John Doorbar (2005), “The papillomavirus life cycle”. Journal of Clinical Virology 32S (2005) S7-S15.
22. Josko Zekan, Maja Sirotkovic-Skerlev and Mihael Skerlev. Oncogenic Aspects of HPV Infections of the Female Genital Tract. In: Herve Seligmann, ed. (2011), “DNA replication-current advances”. ISBN 978-953-307-593-8
23. Karl M, Amy B, Kirsten ME et al. Journal of Virology (2004), “Mechanism of human papillomavirus-induced oncogensis”. 78(21):11451-11460.
24. Karlsen, F., Kalantari, M., Jenkins, A., Pettersen, E., Kristensen G., Holm, R., Johansson, B., & Hagmar, B. (1996), ”Use of multiple PCR primer sets for optimal detection of Human Papillomavirus”. J. Clin. Microbiol. 34:2095-2100.
25. Lee HP, Seo SS (2002), “The application of human papillomavirus testing to cervical cancer screening”. Yonsei Med I; 43(6): 763-768.
26. Nelson, J.H., Hawkins, G.A., Edlund, K., Evander, M., Kjellberg, L., Wadell, G., Dillner, J., Gerasimova, T., Coker, A.L., Pirisi, L., Petereit, D., & Lambert, P.F. (2000), “A novel and rapid PCR-based method for genotyping human papillomaviruses in clinical samples”. J. Clin. Microbiol. 38:688-695.
27. Peitsaro, P., Johansson, B., & Syrjanen, S. (2002), “Integrated human papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as
demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique”. J. Clin. Microbiol. 40:886-891.
28. Pham THA, Nguyen TH, Herrero R, Vaccarella S, Smith JS, Nguyen Thuy TT, Nguyen HN, Nguyen BD, Ashley R, Snijders PJ, Meijer CJ, Munoz N, Parkin DM, Franceschi S, (2003), “Human papillomavirus infection among women in South and North Vietnam”. International Journal of Cancer. 104: 213-220.
29. Peyton, C.L., Schiffman, M., Lorincz, A.T., Hunt, W.C., Mielzynska, I., Bratti, C., Eaton, S., Hildesheim, A., Morera, L.A., Rodriguez, A.C., Herrero, R., Sherman, M.E. & Wheeler, C.M. (1998), “Comparison of PCR-and Hybrid capturebased human papillomavirus detection systems using multiple cervical specimen collection strategies”. J. Clin. Microbiol. 36:3248-3254.
30. Qu, W., Jiang, G., Cruz, Y., Chang, C.J., Ho, G.Y.F., Klein, R.S., & Burk, R.D. (1997), “PCR detection of Human Papillomavirus : Comparision between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer system”. J. Clin. Microbiol. 35:1304-1310.
31. S. de Sanjosé, M. Diaz, X. Castellsagué, G. Clifford, L. Bruni, N. Muñoz, and F. X. Bosch. Jul. (2007), “Worldwide prevalence and genotype distribution of