4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.2.4. Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng
Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR
* Tách chiết RNA tổng số:
Chủng vi khuẩn Salmonella được lựa chọn, nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar. Tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI) để thu được canh khuẩn đạt nồng độ 108 dùng tách RNA.
Quy trình tách RNA thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm tắt quả trình đó như sau:
- Lấy 1ml dịch canh khuẩn đạt nồng độ 108 vào ống Eppendorf 1,5ml, ly tâm 14.000 rpm/10 phút/ 4oC. Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dưới đáy ống.
- Thêm 1ml dung dịch TRIzol vào ống Eppendorf 1,5ml. Nghiền cặn bằng máy sonicate trong 1 phút để hòa tan hoàn toàn.
- Thêm 0,2 ml chloroform/1ml TRIzol. Trộn đều phần dịch tron 15 giây bằng máy vortex.
- Ly tâm 14.000 rpm/10 phút/ 4oC.
- Chuyển toàn bộ phần RNA ở phía trên (pha nước, chiếm khoảng 60% thể tích) sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Tủa RNA với Isopropanol (C3H8O). Thêm 0,6 ml Isopropanol vào ống chưa RNA ở trên. Đảo nhẹ ống bằng tay 6-8 lần.
- Ủ ống ở nhiệt độ - 20oC/ qua đêm hoặc trong 3 giờ. - Ly tâm 14.000 rpm/10 phút/ 4oC.
- Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dưới đáy ống (cặn đó chính là RNA). - Rửa cặn RNA bằng cồn Ethanol 75%: Thêm 1ml cồn Ethanol 75% vào ống eppendorf có chứa cặn RNA, lắc nhẹ bằng tay, ly tâm 6000 rpm/5 phút/ 4oC.
- Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dưới đáy ống. Để khô cặn ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút.
- Pha loãng cặn RNA trong 0,03 - 0,06 ml RNase - free water.
- Ủ ống Eppendorf ở 55-60oC/ 5 phút, lấy ra đặt ngay vào hộp đá trong 5 phút.
- Mẫu RNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch (OD 260/280) trên máy đo quang phổ khả biến (NanoDrop) và các hệ số lắng 5S, 18S, 28S của rRNA bằng điện di sản phẩm trên gel agarose 1%.
- Bảo quản nhiệt độ ở sản phẩm âm sâu (- 80oC) cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
* Tổng hợp cDNA:
Các bước tổng hợp cDNA được thực hiện theo các bước sau:
- Mẫu RNA được lấy ra từ tủ âm sâu (- 80oC) đặt vào hộp đá bào để mẫu tan tự nhiên.
- Hiệu chỉnh mẫu RNA đạt nồng độ 1 g/ l.
- Biến tính RNA ở nhiệt độ 75oC/ 5 phút, lấy ra đặt ngay vào hộp đá trong 5 phút.
- Chuẩn bị hỗn hợp cDNA gồm: 5X buffer (4 l); 0.1M DTT (4 l); dNTP (2 l); Random Primer (2 l); RNase Inhibitor (0,5 l); M ML V-RT (1
l). Lượng được tính cho 1 mẫu.
- Cho 11,8 l hỗn hợp cDNA + 8,5 l mẫu RNA đã hiệu chỉnh (nồng độ 1 g/ l).
- Ủ ở nhiệt độ 37oC/ 60 phút.
- Biến tính ở nhiệt độ 95oC/5phút, lấy ra đặt ngay vào hộp đá bào trong 5 phút.
- Sản phẩm cDNA được bảo quản ở - 20oC cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
* Hỗn hợp phản ứng RT - PCR bao gồm các thành phần:
Phương pháp RT- PCR để phát hiện các gen kháng kháng sinh: Từ các chủng vi khuẩn phân lập từ thực phẩm có kiểu hình kháng kháng sinh đã được xác định, chúng tôi sử dụng phương pháp RT - PCR để xác định các gen kháng kháng sinh. Việc khuếch đại các gen kháng kháng sinh mục tiêu dựa trên việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho từng gen kháng kháng sinh.
Bảng 2.1.Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong nghiên cứu
Nhóm
kháng sinh Gen Trình tự mồi (5’-3’)
Nhiệt độ gắn mồi (ºC) Kích thước sản phẩm (bp)
Tetracycline tetA F TTGGCATTCTGCATTCACTC 55 494
R GTATAGCTTGCCGGAAGTCG
Sulfonamides sul II F CCTGTTTCGTCCGACACAGA 57 434
R GAAGCGCAGCCGCAATTCAT
Streptomycin avrA
F GTTGAGGACCAAAGCAGCTC
55 192
R TCACCACACAGACGTTCACA
Gentamycin aadA F GTTGAGGACCAAAGCAGCTC 55 228
R TCACCACACAGACGTTCACA Betalactams blaTEM /TEM F GCACGAGTGGGTTACATCGA 57 310 R GGTCCTCCGATCGTTGTCAG Fluoroquinolones gyrB F CTGCGCTATCACAGCATCAT 55 219 R CGCGATGGAAATCTGGTACT
Colistin prmA F CACCCCACCACCTCTTTATG 55 187
R GACTGGCCTGAATAGCTTGC Đối chứng 16S rRNA F GCCTACGGGAGGCAGCAG 56 550 R CCGTCAATTCMTTTGAGTTT
* Kiểm tra các sản phẩm của RT-PCR bằng điện di:
Đun tan 2% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98ml, agaroza: 2g), để ấm và đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2µl dung dịch 6X loading bufer với 4µl mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 110V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 µl/ml) 5 phút vớt ra, rửa trong nước 5 phút. Quan sát trên máy soi Gel Doc 1000, version4.6.3, Bio-Rad, CA, USA.
* Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (1µl/ml) trong vòng 5 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số. Kích thước các băng DNA được so với thang chuẩn (marker).