4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
3.2. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonellaspp trên các môi trường
3.2.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thịt lợn, gà, bò
Dựa trên tiêu chuẩn của FAO và Quyết định số 867/QĐ - BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 04/4/1998 thì vi khuẩn Salmonella không được phép có mặt trong 25 gram thực phẩm (thịt tươi, sản phẩm chế biến từ thịt), vì vậy chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra định tính sự có mặt của vi khuẩn này trong các mẫu, chứ không kiểm tra định lượng, từ đó xác định tình trạng ô nhiễm
Salmonella trong thực phẩm có nguồn gốc từ thịt trên địa bàn Hà Nội. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt
Loại thịt Số mẫu kiểm tra Kết quả
Số mẫu dương tính Tỷ lệ %
Thịt lợn 20 6 30,00
Thịt gà 20 6 30,00
Thịt bò 20 2 10,00
Tổng hợp 60 14 23,33
Kết quả bảng 3.1 cho thấy: tỷ lê ̣ dương tính với Salmonella khá cao, trong tổng số 60 mẫu được kiểm tra có 14 mẫu thịt đã phân lập được vi khuẩn Salmonella spp. chiếm tỷ lệ 23,33%. Trong đó, tỷ lệ phân lập được
Salmonella spp. ở thịt gà và thịt lợn chiếm tỷ lệ 30,00% cao hơn ở mẫu thịt bò (10,00%). Theo TCVN 7046:2009 quy định, trong thịt và sản phẩm của thịt không được phép có mặt vi khuẩn Salmonella. Như vậy, căn cứ theo quy định trên và trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này thì có tới 23,33% các mẫu thịt không đạt tiêu chuẩn. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu năm 2007 của nhóm tác giả Nguyễn Thị Kê, khi kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật của 100 mẫu thực phẩm thuộc các nhóm thịt, thủy sản, sữa và các loại bánh theo phương pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với Salmonella từ 8-20% [8].
Xét riêng tỷ lệ từng loại thịt ta thấy 30% thịt gà, 30% thịt lợn và 10% thịt bò đã được xác định là có nhiễm vi khuẩn Salmonella ssp. Kết
quả này tương đương với một số nghiên cứu mới được công bố gần đây. Trong một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau trong thịt tươi tại các chợ tự do trên địa bàn Hà Nội, Đỗ Ngọc Thúy và cs.
(2006) đã xác định được tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trung bình trong thịt là 30% (trong đó có 47,1% ở thịt gà, 27,3% ở thịt lợn và 19% ở thịt bò). Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Paster thành phố Hồ Chí Minh (Tp. HCM) đã lấy mẫu ngẫu nhiên 1150 mẫu thực phẩm thịt heo, gà, bò tươi sống tại các chợ trên địa bàn Tp. HCM để làm xét nghiệm. Kết quả cho thấy, 385 mẫu thịt nhiễm khuẩn Salmonella. Trong đó, tỷ lệ nhiễm khuẩn
Salmonella trong thịt lợn cao nhất chiếm 39,20%, thịt gà chiếm 35,17%, thịt bò chiếm 30,80%. Tính trung bình, tỷ lệ thịt động vật tươi sống bày bán tại các chợ nhiễm khuẩn Salmonella tới 32,26% [1]. Điều này cho thấy, thực trạng của việc sản xuất thực phẩm tươi sống của nước ta trong những năm qua chưa được cải thiện, chưa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Việc tạp nhiễm Salmonella có thể do nguồn nước bị ô nhiễm; sự vấy nhiễm vi sinh vật lên sản phẩm trong các công đoạn cắt tiết, nhổ lông... hay từ dụng cụ, công nhân; quy trình giết mổ không tuân thủ nguyên tắc một chiều từ khâu giết mổ sang khâu rửa sạch sản phẩm. Theo FAO và WHO trong số các bệnh nhân bị ngộ độc thịt thì có đến 90% do thịt bị vấy nhiễm trong quá trình giết mổ và chỉ có 10% là do thịt gia súc bị bệnh. Theo Browkaj (1989), khi chọc tiết bằng dao nhiễm khuẩn hoặc nhúng lợn vào nước lúc tim còn co bóp, vi khuẩn sẽ chuyển vào mạch máu rồi đến các bắp thịt. Thịt sau khi mổ được vận chuyển đơn sơ, không bao gói bảo quản, thêm vào đó, việc bày bán tự do ở chợ suốt cả ngày, người mua, người bán có thể nâng lên, đặt xuống để lựa chọn, mặc cả đã làm cho thịt càng dễ nhiễm vi khuẩn. Nghiên cứu của một số tác giả cho rằng thịt bị ô nhiễm Salmonella sau khi giết mổ, kiểm tra thấy sự nhiễm khuẩn lớn hơn do bị nhiễm khuẩn là từ phân, da, lông, móng, chất chứa trong ruột, dụng cụ cắt thịt, khay đựng, không khí, đất nước của lò mổ, ngoài ra còn sự nhiễm khuẩn từ quần áo, chân tay công nhân [11].
Đây cũng là cảnh báo cho các nhà quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm trong việc tăng cường giám sát chặt chẽ ô nhiễm Salmonella trong thịt gia súc, gia cầm để phòng ngừa các bệnh truyền qua thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
3.2.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được
Dựa trên đặc tính sinh học khác nhau của mỗi loài vi khuẩn như: tính chất mọc trên các môi trường thông thường, môi trường đặc biệt, khả năng chuyển hóa đường, khả năng sản sinh các hợp chất sinh học trung gian trong quá trình phát triển ở môi trường nuôi cấy... có thể sử dụng những đặc điểm này để phát hiện, nhận biết chúng. Vi khuẩn Salmonella
được nuôi cấy, phân lập trên các loại môi trường: BPW, Rambach agar, MK, XLT4 agar, Kligler agar.
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của các chủng Salmonella spp. trong quá trình phân lập
STT Chỉ tiêu kiểm tra Số chủng Đặc điểm Kết quả (+) Tỷ lệ (%)
1 BPW 14 Môi trường đục đều 14 100,00
2 MSRV 14
Vi khuẩn phát triển lan rộng ra xung quanh giọt canh khuẩn tạo 1 vầng trắng, có thể lan khắp bề mặt thạch. 14 100,00 3 MK 14 Môi trường đục 14 100,00 4 Rambach agar 14 Khuẩn lạc có kích thước trung bình, dạng S, màu hồng cánh sen, không làm biến đổi màu môi trường
8 57,14
5 XLT4 agar 14 Khuẩn lạc có kích thước
Sau khi xác định đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella
trên một số môi trường đặc hiệu, chúng tôi tiếp tục tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được STT Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Theo ISO 6579 - 2003 1 Glucose 14 14 100,00 + 2 Lactose 14 0 0,00 - 3 H2S 14 14 100,00 + 4 Sinh hơi 14 6 42,86 +/- 5 Simmoncitrate 14 14 100,00 + 6 Ureaza broth 14 0 0,00 - 7 Lysine decarboxylase broth 14 14 100,00 +
Từ bảng 3.2 cho thấy: 100% các chủng Salmonella được kiểm tra đều dương tính với H2S, Glucose, Simmoncitrate, Lysine decarboxylase broth và không có chủng nào lên men đường Lactose và ureaza. Có 6/14 chủng có khả năng sinh hơi tương ứng với 42,86%.
Như vậy, đặc tính sinh vật hoá học của các chủng Salmonella spp. phân lập được mang đặc điểm chung của giống Salmonella và phù hợp với những đặc điểm về hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh hoá của vi khuẩn này theo như mô tả của Quinn và cs (2004), cũng như các tác giả khác như: Phùng Quốc Chướng (1995), Cù Hữu Phú và cs (2000), Đỗ Trung Cứ (2004) khi nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella [65],[65],[65].
3.3.Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được
Theo Quinn và cs (2004), để xác định seroar của vi khuẩn Salmonella
spp. nên lấy khuẩn lạc phát triển ở phần nghiêng của thạch TSI hoặc từ môi trường thạch thường. Trước hết, kiểm tra với kháng nguyên nhóm O, sau đó là kháng huyết thanh nhóm H.
Kết quả định type kháng huyết thanh của chủng Salmonella spp. được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. Chủng kiểm tra Công thức kháng nguyên Định typ Số mẫu Kháng nguyên O Kháng nguyên H Pha 1 Pha 2 Mẫu có nguồn gốc từ thịt lợn (6) 3,10 e,h l,w Salmonella Meleagridis 1 3, 10 l,v 1,7 Salmonella Give 1 1,4,12 f,g 1,2 Salmonella Derby 1 1,4,12 i 1,2 Salmonella Typhimurium 3 Mẫu có nguồn gốc từ thịt gà (6) 7 f,g - Salmonella Rissen 2 1,6,14 g,m - Salmonella Warragul 2 1,4,12 z 1,7 Salmonella Indiana 2 Mẫu có nguồn gốc từ thịt bò (2) 1,4,12 f,g 1,2 Salmonella Derby 2 Giống Salmonella được chia thành nhiều serotype (khoảng 2300 serotype) theo xếp loại của Kauffmann-White, dựa theo kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Kết quả xác định serotype theo tiêu chuẩn của WHOCC- Salm [34]. Như vậy, sự có mặt của các thành phần kháng nguyên O và kháng nguyên H là căn cứ để xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella. Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy 7 chủng Salmonella đã xác định được serotype, bao gồm Salmonella Meleagridis, Warragul, Derby, Indiana, Give, Rissen, Typhimurium. Trong đó các chủng Salmonella phân lập được từ mẫu thịt lợn là Salmonella Typhimurium, Meleagridis, Give, Derby, Warragul, từ mẫu thịt gà gồm chủng Salmonella Typhimurium, Rissen, Indiana, Warragul, riêng mẫu thịt bò chỉ phân lập được chủng Salmonella Derby.
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Thị Ngọc (2013), tiến hành định type kháng nguyên huyết thanh 82 chủng Salmonella phân lập được từ
trang trại và lò mổ tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam cho thấy có 3 serovar chủ yếu là Derby (25,6%), Typhimurium (23,2%) và Rissen (13,4%), các serovar khác bao gồm Anatum, Braenderup, Chartres và Meleagridis có tỷ lệ dao động từ 2,4% đến 6,1% [12].
Kết quả tương tự cũng thu được khi phân lập các chủng vi khuẩn
Salmonella ở các mẫu thị lợn và thịt gà bán lẻ tại các chợ thuộc miền Nam Thái Lan. Tỷ lệ dương tính Salmonella trên thịt lợn là 82%, thịt gà là 67,5% trong đó serotype Albany chiếm phần lớn (44,7%), sau đó là Typhimurium (33,3%) và Rissen (28,3%) [48].
Ở Phần Lan, 60 mẫu dương tính vi khuẩn Salmonella enterica phân lập từ thịt lợn cho thấy có 9 serotype xuất hiện, chủ yếu là Typhimurium (53,3%), Derby (18,3%), Rissen (6,6%), Mbandaka (5%), London (5%), Give (3,3%), Enteritidis (1,6%) và Sandiego (1,6%) [37].
Ở miền Nam Thái Lan, một kết quả cũng tương tự thu được khi thu được các chủng Salmonella ở các mẫu thị lợn, thịt gà bán lẻ tại các chợ. Tỷ lệ dương tính Salmonella trên thịt lợn là 82%, thịt gà là 67,5% trong đó serotype Albany chiếm phần lớn (44,7%), sau đó là Typhimurium (33,3%) và Rissen (28,8%) [48].
Theo Thanh Hà (2014) trong số trên 2500 type huyết thanh đã được phân lập, S. Enteritidis và S. Typhimurium là hai type huyết thanh thông thường nhất gây ngộ độc thực phẩm cho người.
Như vậy cần có các nghiên cứu sâu hơn và khả năng kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium trong việc cảnh báo các nguy cơ lây nhiễm, nhằm đảm bảo sức khỏe cộng đồng.
3.4. Kết quả xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Salmonella
Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được
Kết quả thử khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch của các chủng Salmonella Typhimurium phân lập được.
S181 S360
S384
Hình 3.3 Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3 type Salmonella
Typhimurium (ST) phân lập được
Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được
STT Tên chủng Kháng kháng sinh
1 ST (S181) AMP, STR, TET
2 ST (S360) AMP, STR, CHL, TET, SXT 3 ST (S384) AMP, STR, GEN, CHL, TET, SXT
(Ghi chú: AMP: Ampicillin, STR: Streptomycin, GEN: Gentamycine, CHL:
Ba chủng Salmonella Typhimurium(kí hiện là:S181, S360, S384) phân lập từ thịt lợn tại một số chợ bán lẻ trên địa bàn Hà Nội được lựa chọn để tiến hành thử khả năng kháng kháng sinh. Quy trình thử nghiệm kháng sinh được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Kiểm tra đường kính vùng ức chế vi khuẩn của kháng sinh sau 24 giờ bằng máy đo tự động Flash & Go. Kết quả cho thấy S181 có khả năng kháng kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Tetracyclin. S360 có khả năng kháng kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Sulfamethoxazol/Trimetoprim. S384 có khả năng kháng kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Sulfamethoxazol/Trimetoprim và Gentamycine được trình bày như trên bảng 3.5.
Cũng như các loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác, Salmonella
cũng kháng với nhiều loại kháng sinh, mà nguyên nhân là do trong quá trình chăn nuôi, trong điều trị bệnh như dùng không đúng liều lượng, không đủ thời gian và khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn với nhau. Tác giả Nguyễn Quang Tuyên (1996) cho thấy 100% số chủng Salmonella nghiên cứu mẫn cảm mạnh với Chloramphenicol, mẫn cảm trung bình với Neomycin và kháng mạnh với Chlotetracyclin, Penicillin, Ampicilin và Sulphonamide [24]. Các chủng Salmonella có độ mẫn cảm cao với Furazolidon (100%), Chloramphenicol (87,5%) và ít mẫn cảm với Penicillin (25%), hoàn toàn kháng với Tetracyclin [3]. Với 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm, nhóm tác giả Hoàng Hoài Phương khi kiểm tra tỷ lệ kháng kháng sinh đã cho thấy: tỷ lệ kháng Chloramphenicol là 67,5%, Tetracyclin (65,0%), Sulfamethoxazole-Trimethỏim (37,5%), Ampicillin (37,5%), Nalidixic acid (17,5%), Ciprofloxacin (12,5%), Gentamicin (5%) [15].
Như vậy, hầu hết các chủng S181, S360, S384 phân lập được từ các mẫu thịt trong nghiên cứu của chúng tôi đều có khả năng kháng lại các loại kháng sinh có hoạt phổ rộng như: Ampicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Gentamycine, Chloramphenicol, Sulfamethoxazol/Trimetoprim, các loại kháng sinh thường được sử dụng nhiều trong chăn nuôi.
3.5. Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các chủng
Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được
3.5.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella
Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA.
Hình 3.4. Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3 chủng Salmonella
1,2,3: S181, S360, S384
Ở Hình 3.3 cho thấy tất cả mẫu RNA tổng số đều biểu hiện rõ 2 băng vạch 28S và 18S ribosom RNA, chứng tỏ các mẫu RNA tách chiết từ mẫu vi khuẩn Salmonella Typhimurium đều đạt tiêu chuẩn để tổng hợp cDNA cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium.
Ba chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 sau khi tách chiết RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA làm khuôn cho phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi cho gen mã hóa kháng Tetracyclines (tetA), Sulfonamides (sul II), Chloramphenicol (avrA), Aminoglycosides (aadA),
Betalactams (blaTEM), Quinolones (gyrB), Colistin (prmA) và gen đối chứng
16S rRNA.
Biểu hiện ở các hình sau đây:
Hình 3.5. Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp)
của chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384
Kết quả hình 4 cho thấy: sản phẩm PCR ở các giếng có băng vạch có kích thước tương đương với kích thước lý thuyết của gen 16S rRNA(550bp).
Gen avrA Gen aadA
Gen prmA Gen gyrB
Gen blaTEM
Hình 3.6. Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp), sull II (434bp,
avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB (219bp), prmA (187bp) của chủng
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chủng Salmonella
Typhimurium S181, S360, S384 kháng kháng sinh có chung kiểu hình kháng tetracyclines (tetA), sulfonamides (sul II), chloramphenicol (avrA), aminoglycosides (aadA), betalactams (blaTEM), quinolones (gyrB), colistin (prmA).
3.6. Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng Salmonella
Typhimurium
Gen tetA (494bp) mã hóa kháng tetracycline, gen sul II (434bp) mã hóa kháng sulfonamid, gen avrA (192bp) mã hóa kháng chloramphenicol, gen aadA (228bp) mã hóa kháng aminoglycosid, gen blaTEM (310bp) mã hóa kháng betalactam, gen gyrB (219bp) mã hóa kháng quinolon, gen prmA
(187bp) mã hóa kháng colistin đã được tìm thấy trên các đoạn DNA bổ sung (cDNA).
Gen blaTEM Gen gyrB
Hình 3.7. Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB, prmA/16S
rRNA của chủng Salmonella Typhimurium được phân tích bằng phương pháp
RT-PCR. Gen 16S rRNA được dùng để so sánh
Tetracycline là nhóm kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn do kháng sinh có thể gắn lên các ribosome. Kháng sinh này được sử dụng rộng rãi điều trị bệnh vật nuôi và bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ rất lâu. Tuy nhiên, một trong những vấn đề lớn khi sử dụng loại kháng sinh này là hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc.
Với sản phẩm PCR có kích thước 494bp (Hình 3.5 ở cả 3 giếng) thì cả 3 chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 phân lập được từ thịt tươi ở một số địa điểm ở Hà Nội đều mang gen tetA mã hóa kháng tetracycline.
Sự biểu hiện của gen tetA mã hóa kháng tetracycline ở chủng S181 có tỷ lệ 12,4% thấp hơn so với S360 là 93,7% và S384 là 98%. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella Typhimurium S360 và S384 đều kháng tetracycline với tỷ lệ cao (Hình 6.) ở mức độ sai khác có tính toán (p < 0,05).
Tương tự, với các sản phẩm PCR có kích thước gen 434bp, 192bp, 228bp, 310bp, 219bp, 187bp (Hình 5 ở cả 3 giếng) thì cả 3 chủng Salmonella