- Sản xuất phân bón VSV dạng hạt từ chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Bacillus megaterium VACC 118 và hỗn hợp chất mang chứa tinh bột biến tính và sodium alginate
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu.
- Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 được tuyển chọn từ Bộ
giống vi sinh vật trồng trọt của Viện Thổ nhưỡng nông hóa.
- Các cây giống cà chua, cải bắp và cải củ khỏe mạnh, đồng nhất được cung
cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Phân bón và Dinh dưỡng cây trồng, thuộc Viện Thổ nhưỡng nông hóa.
- Tinh bột sắn được mua từ Công ty Cổ phần bột thực phẩm Tài Ký, Việt Nam
- Các hóa chất cần thiết để chuẩn bị môi trường nhân giống, phối trộn chất
mang thuộc loại hóa chất công nghiệp, được sử dụng trực tiếp mà không tinh chế thêm
- Giống cấp 1 được chuẩn bị theo điều kiện như Bảng 4
Bảng 4. Điều kiện nhân sinh khối đối với B.megaterium VACC 118
Thông số kỹ thuật Điều kiện
Môi trường nhân giống Nước chiết đậu
Thời gian nhân sinh khối (giờ) 48
pH môi trường 7,0
Nhiệt độ nhân giống (oC) 30
Vận tốc cánh khuấy (vòng/phút) 250
2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
- Bốc cấy vô trùng Esco, Singapore
- Tủ ấm, Trung Quốc
- Hệ thống lên men BIOSTART B10/Fermentor
- Thiết bị chiếu xạ tia gamma sử dụng nguồn chiếu Cobalt-60 (Trung tâm
Chiếu xạ Hà Nội, Viện Năng lượng nguyên tử Việt Nam)
- Máy li tâm Eppendorf, Đức
- Dụng cụ phối trộn, tạo hạt phân bón sản xuất trong nước
- Tủ sấy, tủ an toàn sinh học
- pipet, que cấy, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, và các dụng cụ khác của
Trung Quốc và Việt Nam.
2.3. Môi trƣờng nuôi cấy VSV sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm của nghiên cứu này được liệt kê như Bảng 5
Bảng 5. Các môi trường nuôi cấy và nhân sinh khối vi khuẩn
Tên môi trƣờng Thành phần Số lƣợng pH King B Pepton Glyxerin K2HPO4 MgSO4.7H2O Nước cất 10g 10g 1.5g 1.5g 1000ml 6.8-7.0 Nƣớc chiết đậu Glucose Saccharose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 CaCO3 Đậu Nước cất 5g 5g 0.5g 0.5g 0.5g 1g 1g 100g 1000ml 6.8-7.0 Môi trƣờng SX BA Rỉ đường Cao nấm men CaCO3
Nước chiết đậu Nước cất 20g 5g 1g 200ml 800ml 6.8-7.0 Thạch LB Cao nấm men Peptone NaCl Thạch Nước cất 5g 10g 10g 12g 1000 ml 6.8-7.0
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Hoạt hóa chủng B.megaterium VACC 118
Chủng B.megaterium VACC 118 được lấy ra từ lạnh âm sâu và ria lên đĩa
thạch King B (Bảng 5). Sau 24h ủ ở nhiệt độ 30°C, sự phát triển, thuần chủng và khả năng hình thành khuẩn lạc được kiểm tra theo phương pháp Knock.
2.4.2. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118phù hợp
Quá trình lên men thử nghiệm, được thực hiện trên thiết bị lên men chìm quy mô 3 lít/mẻ, với các thông số kỹ thuật thay đổi. Sau quá trình nhân sinh khối, mật độ vi khuẩn sinh tổng hợp IAA được xác định theo TCVN 10784:2015 [3]. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường dinh dưỡng, kiểu nuôi cấy, thời gian, nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống gốc) đến sự phát triển của các chủng VSV kích thích sinh trưởng thực vật được xác định căn cứ trên mật độ tế bào thu được và hoạt tính sinh học của VSV. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của B.megaterium VACC 118
Ba môi trường được sử dụng để khảo sát hiệu quả lên men của B.megaterium
VACC 118gồm King B, nước chiết đậu, và SX BA. Song song khảo sát môi trường
phù hợp, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi lên mật độ VSV qua ba mốc thời gian 24h, 48h, 72h. Các thông số kỹ thuật khác sử dụng trong quá trình nhân sinh khối được giữ không thay đổi gồm nhiệt độ môi trường lên men (T = 30ºC), tỷ lệ giống cấp I là 3%, lượng khí cấp 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, pH 7.0
2.4.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để lựa chọn được vùng pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng của
B.megaterium VACC 118, chúng tôi đã sử dụng dung dịch đệm để chuẩn bị môi trường nhân sinh khối như trình bày trên Bảng 6.
Bảng 6. Hỗn hợp đệm pH pha môi trường nước chiết đậu pH dung dịch (200 ml) Thể tích dung dịch KH2PO4 0,1 M (ml) Thể tích dung dịch NaOH 0,1 M (ml) Thể tích nƣớc cất bổ sung (ml) 5,0 100,0 4,2 95,8 5,5 100,0 6,7 93,3 6,0 100,0 11,2 88,8 6,5 100,0 27,8 72,2 7,0 100,0 58,2 41,8 7,5 100,0 82,2 17,8
Trong thí nghiệm này, môi trường sản xuất được chọn là môi trường cho hiệu quả lên men tốt nhất như đã khảo sát ở mục 2.4.2.1, các thông số kỹ thuật khác sử dụng trong quá trình nhân sinh khối được giữ không thay đổi gồm nhiệt độ môi trường lên men (T = 30°C), tỷ lệ giống cấp I là 3%, thời gian lên men khảo sát tại 0h, 48h và 72h; lượng khí cấp 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút.
2.4.2.3. Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men, chủng vi sinh vật được nhân sinh khối trong bình lên men ở các nhiệt độ 25, 30 và 35C, trong khi các điều kiện lên men khác không thay đổi (sử dụng môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ sục khí 0.75 lít không khí /lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống cấp I 3,0 %).
2.4.2.4. Đánh giá ảnh hƣởng của lƣu lƣợng cấp khí và tốc độ khuấy đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
trường/phút . Các yếu tố khác như lượng giống gốc được giữ cố định là 3%, được nuôi cấy trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút.
Tương tự như các thí nghiệm trên, để xác định tốc độ khuấy thích hợp cho quá trình lên men, vận tốc cánh khuấy của thiết bị lên men được điều chỉnh thay đổi từ 200, 250, 300, 350 và 400 vòng/phút. Các yếu tố khác như lượng giống gốc được giữ cố định là 3%, được nuôi cấy trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1.
2.4.2.5. Đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ giống gốc đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Trong nghiên cứu ảnh hưởng giống cấp 1 đến quá trình lên men thu sinh khối, lượng sinh khối được sử dụng ở các tỷ lệ 1,0; 2,0; 3,0% so với địch lên men,
các yếu tố khác không thay đổi, trong đó B.megaterium VACC 118 được nuôi cấy
trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ cánh khuấy và lưu lượng cấp khí cho hiệu quả lên men tốt nhát khảo sát ở mục 2.4.2.4.
2.4.3. Tạo hạt phân bón vi sinh vật
B.megaterium VACC 118 sau khi được hoạt hóa trên King B, sẽ được chuyển qua len men trên môi trường nước chiết đậu ở 30ºC trong 5 ngày để tạo bào tử. Dung dịch được thu khi quá trình lên men đạt tới pha cân bằng. Nồng độ dịch vi sinh sẽ được cô đặc nhờ ly tâm 3000 rpm, để đạt nồng độ khoảng 1011 CFU/ml trước khi được sử dụng để tạo hạt phân bón.
Tinh bột biến tính được chuẩn bị từ tinh bột sắn thương mại đem chiếu xạ gamma với liều chiếu 3,5 kGy [1] được phối trộn cùng dung dịch sodium alginate đã khử trùng với tỉ lệ 2% sodium alginate và 33% tinh bột biến tính để thu được dung dịch tinh bột – alginate (SA). Tiếp tục phối trộn dung dịch lên men
B.megaterium đã cô đặc ở trên với dung dịch SA theo tỉ lệ 1:2, sau đó hỗn hợp được
nhỏ tạo hạt vào bể chứa dung dịch 2% CaCl2 tiệt trùng kèm khuấy từ để thu được
các hạt kết tủa (Hình 2).
Hình 2. Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón
Sau khi tạo hạt, tiếp tục khuấy nhẹ trong 30 phút để khâu mạch, đảm bảo tính ổn định của các hạt được tạo thành. Sau khi kết thúc khuấy, các hạt phân bón ẩm được thu gom, rửa một vài lần bằng nước cất để loải bỏ các ion kiềm còn dư trước khi làm khô. Hạt phân bón ẩm được làm khô ở nhiệt độ 38±2ºC đến độ ẩm dưới 10% và đóng gói vào túi thiếc để bảo quản cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3). Toàn bộ quá trình tạo hạt và làm khô được thực hiện trong tủ an toàn sinh học để hạn chế tối đa việc nhiễm tạp.
Hình 3. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt
2.4.4. Đánh giá chất lƣợng của phân bón vi sinh dạng hạt
Tỉ lệ trƣơng nƣớc: Hạt phân bón khô được ngâm trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.85%, pH 7) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và tỉ lệ trương nước (PS) được xác định bằng tỉ lệ khối lượng sau khi trương lên so với khối lượng hạt ban đầu theo công thức sau:
PS = 100(Ws Wd)/Wd
Tốc độ giải phóng VSV: 1g hạt phân bón khô được ngâm trong 100 ml nước muối sinh lý khử trùng trong vòng 1 tuần, khuấy từ nhẹ để xác định tốc độ giải phóng VSV. Lượng tế bào VSV giải phóng vào dung dịch nước muối được xác đính
au 1, 2 và 7 ngày. Trong thí nghiệm này, mật độ B.megaterium được xác định bằng
kĩ thuật đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch LB bổ sung L-tryptophan theo TCVN 10784:2015 [3].
Thời gian bảo quản: Các hạt phân bón khô được đóng gói trong túi PE tráng kẽm, và giữ trong phòng sạch. Sau 7, 30, 90 và 180 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ sống của VSV trong hạt phân bón được đánh giá theo quy trình sau: (1) 1g hạt phân bón khô, ngâm trong 10 ml dung dịch nước muối sinh lý trong 30 phút cho trương nở; (2) Các hạt sau khi hút no nước, được chuyển qua 100 ml dung dịch 10% sodium tricitrat trong 30 phút và lắc nhẹ; (3) Nồng độ VSV trong dung dịch được đánh giá bằng phương pháp cấy trải đếm khuẩn lạc trên thạch LB, ủ 37°C trong 48 giờ.
2.4.5. Đánh giá ảnh hƣởng của phân bón VSV đối với cây rau
Cây rau khảo sát được trồng và chăm sóc theo quy trình của địa phương từ tháng 8/2018 đến tháng 3/2019, tùy từng loại cây. Các cây non được trồng trong vườn ươm trước khi được chyển sang trồng ngoài đồng ruộng. Cây con có 3-5 lá thật được trồng thủ công trên ruộng thí nghiệm, vào các lỗ đã được bón lót bằng phân chuồng và NPK theo quy định, và được bổ sung khoảng 20-25 hạt (~ 1,0 gam) phân bón vi sinh. Mật độ trồng từ 30-35.000 cây/ha theo từng loại cây. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến cây rau được xác định đối với cây trồng trên đất phù sa tại các huyện Phúc Thọ và Hoài Đức, Hà Nội. Trong nghiên cứu này, công thức
đối chứng áp dụng nền NPK gồm phân cuồng và 120 kg N, 60 kg P2O5 và 80 kg
K2O cho mỗi ha; Thí nghiệm 1: Phân chuồng + 100% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha;
Thí nghiệm 2: Phân chuồng + 80% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha. Một số chỉ tiêu nông học của cây trồng được theo dõi và so sánh để đánh giá hiệu quả của phân vi sinh tạo được [27].
Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, và số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL và IRRISTAT 5.1.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium
VACC 118 và đánh giá chất lƣợng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt.
3.1.1. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118thích hợp 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá
trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Trong sản xuất công nghiệp, môi trường lên men tốt giúp đảm bảo đủ dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt. Dù King B là loại môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh IAA [8], song thành phần của môi trường này tương đối phức tạp, hầu hết thuộc loại hóa chất phải nhập khẩu, rất đắt tiền nên không thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp nên quá trình lựa chọn môi trường phù hợp để sản xuất quy mô lớn là hết sức cần thiết.
Trong thí nghiệm này, môi trường King B cùng với hai loại môi trường dùng trong lên men sản xuất thu dịch vi sinh là môi trường nước chiết đậu và SX BA đã được sử dụng. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào cũng được khảo sát và kết quả được trình bày trên Bảng 7.
Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của B.megaterium VACC 118
Môi trƣờng lên men Thời gian lên men
(giờ) King B (CFU/ml) Chiết đậu (CFU/ml) SX BA (CFU/ml) 0 giờ (2,90±0,45) x104 (4,00±0,34) x104 (2,80±0,44) x 104 48 giờ (2,00±0,30) x108 (3,70±0,25) x 108 (1,20±0,38) x 108 72 giờ (2,60±0,22) x107 (5,30±0,22) x 107 (2,40±0,33) x 107
Số liệu tại Bảng 7 cho thấy, chủng vi khuẩn B.megaterium VACC 118 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, mật độ tế bào trong
dịch lên men đạt mức cao hơn so với hai môi trường còn lại với 3.70 x 108 CFU/ml
dịch lên men sau 48h nuôi. Kết quả khảo sát cũng chỉ ra rằng, thời gian nuôi lý tưởng là 48h vì tại đây mức sinh khối VSV đạt cao nhất và có thể quần thể VSV đang ở pha cân bằng. Khi thời gian nuôi tăng lên 72h, nồng độ VSV bị giảm rõ rệt, chứng tỏ VSV lên men đã chuyển qua pha suy vong.
Trên cơ sở kết quả thu được, có thể nhận xét rằng chủng B.megaterium
VACC 118 phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, và thời gian nuôi cấy 48h được áp dụng như điều kiện tiên quyết để thực hiện tiếp các khảo sát điều kiện lên men của B.megaterium VACC 118.
3.1.1.2.Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion. Những biến đổi về nồng độ của chúng dù nhỏ cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp thu, trao đổi chất của vi sinh vật [53]. Trong thí nghiệm này, sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn sinh IAA được khảo sát trên môi trường nước chiết đậu ở các pH khác nhau, kết quả được trình bày trong Bảng 8.
Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của B.megaterium VACC 118.
pH môi trƣờng Thời gian pH 6,0 (CFU/ml) pH6,5 (CFU/ml) pH7,0 (CFU/ml) pH7,5 (CFU/ml) 48 giờ (3,80±0,25) x 10 7 (9,10±0,20) x 107 (7,50±0,21) x 108 (3,70±0,26) x 108 72 giờ (2,60±0,11) x 10 6 (4,70±0,28) x 107 (2,90±0,18) x 107 (2,50±0,18) x 107
Kết quả Bảng 8 cho thấy: vùng pH môi trường thích hợp nhất cho
B.megaterium VACC 118 phát triển là 7,0, tại pH môi trường này chủng vi khuẩn
nghiên cứu đạt mật độ tế bào cao khoảng 7.50 x 108 CFU/ml dịch lên men. Cũng