Quá trình lên men thử nghiệm, được thực hiện trên thiết bị lên men chìm quy mô 3 lít/mẻ, với các thông số kỹ thuật thay đổi. Sau quá trình nhân sinh khối, mật độ vi khuẩn sinh tổng hợp IAA được xác định theo TCVN 10784:2015 [3]. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường dinh dưỡng, kiểu nuôi cấy, thời gian, nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống gốc) đến sự phát triển của các chủng VSV kích thích sinh trưởng thực vật được xác định căn cứ trên mật độ tế bào thu được và hoạt tính sinh học của VSV. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của B.megaterium VACC 118
Ba môi trường được sử dụng để khảo sát hiệu quả lên men của B.megaterium
VACC 118gồm King B, nước chiết đậu, và SX BA. Song song khảo sát môi trường
phù hợp, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi lên mật độ VSV qua ba mốc thời gian 24h, 48h, 72h. Các thông số kỹ thuật khác sử dụng trong quá trình nhân sinh khối được giữ không thay đổi gồm nhiệt độ môi trường lên men (T = 30ºC), tỷ lệ giống cấp I là 3%, lượng khí cấp 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, pH 7.0
2.4.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để lựa chọn được vùng pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng của
B.megaterium VACC 118, chúng tôi đã sử dụng dung dịch đệm để chuẩn bị môi trường nhân sinh khối như trình bày trên Bảng 6.
Bảng 6. Hỗn hợp đệm pH pha môi trường nước chiết đậu pH dung dịch (200 ml) Thể tích dung dịch KH2PO4 0,1 M (ml) Thể tích dung dịch NaOH 0,1 M (ml) Thể tích nƣớc cất bổ sung (ml) 5,0 100,0 4,2 95,8 5,5 100,0 6,7 93,3 6,0 100,0 11,2 88,8 6,5 100,0 27,8 72,2 7,0 100,0 58,2 41,8 7,5 100,0 82,2 17,8
Trong thí nghiệm này, môi trường sản xuất được chọn là môi trường cho hiệu quả lên men tốt nhất như đã khảo sát ở mục 2.4.2.1, các thông số kỹ thuật khác sử dụng trong quá trình nhân sinh khối được giữ không thay đổi gồm nhiệt độ môi trường lên men (T = 30°C), tỷ lệ giống cấp I là 3%, thời gian lên men khảo sát tại 0h, 48h và 72h; lượng khí cấp 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút.
2.4.2.3. Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men, chủng vi sinh vật được nhân sinh khối trong bình lên men ở các nhiệt độ 25, 30 và 35C, trong khi các điều kiện lên men khác không thay đổi (sử dụng môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ sục khí 0.75 lít không khí /lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống cấp I 3,0 %).
2.4.2.4. Đánh giá ảnh hƣởng của lƣu lƣợng cấp khí và tốc độ khuấy đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
trường/phút . Các yếu tố khác như lượng giống gốc được giữ cố định là 3%, được nuôi cấy trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút.
Tương tự như các thí nghiệm trên, để xác định tốc độ khuấy thích hợp cho quá trình lên men, vận tốc cánh khuấy của thiết bị lên men được điều chỉnh thay đổi từ 200, 250, 300, 350 và 400 vòng/phút. Các yếu tố khác như lượng giống gốc được giữ cố định là 3%, được nuôi cấy trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1.
2.4.2.5. Đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ giống gốc đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Trong nghiên cứu ảnh hưởng giống cấp 1 đến quá trình lên men thu sinh khối, lượng sinh khối được sử dụng ở các tỷ lệ 1,0; 2,0; 3,0% so với địch lên men,
các yếu tố khác không thay đổi, trong đó B.megaterium VACC 118 được nuôi cấy
trên môi trường khảo sát có hiệu quả tốt nhất ở mục 2.4.2.1., pH cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất khảo sát tại mục 2.4.2.2., thời gian lên men khảo sát tại mục 2.4.2.1, tốc độ cánh khuấy và lưu lượng cấp khí cho hiệu quả lên men tốt nhát khảo sát ở mục 2.4.2.4.
2.4.3. Tạo hạt phân bón vi sinh vật
B.megaterium VACC 118 sau khi được hoạt hóa trên King B, sẽ được chuyển qua len men trên môi trường nước chiết đậu ở 30ºC trong 5 ngày để tạo bào tử. Dung dịch được thu khi quá trình lên men đạt tới pha cân bằng. Nồng độ dịch vi sinh sẽ được cô đặc nhờ ly tâm 3000 rpm, để đạt nồng độ khoảng 1011 CFU/ml trước khi được sử dụng để tạo hạt phân bón.
Tinh bột biến tính được chuẩn bị từ tinh bột sắn thương mại đem chiếu xạ gamma với liều chiếu 3,5 kGy [1] được phối trộn cùng dung dịch sodium alginate đã khử trùng với tỉ lệ 2% sodium alginate và 33% tinh bột biến tính để thu được dung dịch tinh bột – alginate (SA). Tiếp tục phối trộn dung dịch lên men
B.megaterium đã cô đặc ở trên với dung dịch SA theo tỉ lệ 1:2, sau đó hỗn hợp được
nhỏ tạo hạt vào bể chứa dung dịch 2% CaCl2 tiệt trùng kèm khuấy từ để thu được
các hạt kết tủa (Hình 2).
Hình 2. Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón
Sau khi tạo hạt, tiếp tục khuấy nhẹ trong 30 phút để khâu mạch, đảm bảo tính ổn định của các hạt được tạo thành. Sau khi kết thúc khuấy, các hạt phân bón ẩm được thu gom, rửa một vài lần bằng nước cất để loải bỏ các ion kiềm còn dư trước khi làm khô. Hạt phân bón ẩm được làm khô ở nhiệt độ 38±2ºC đến độ ẩm dưới 10% và đóng gói vào túi thiếc để bảo quản cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3). Toàn bộ quá trình tạo hạt và làm khô được thực hiện trong tủ an toàn sinh học để hạn chế tối đa việc nhiễm tạp.
Hình 3. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt
2.4.4. Đánh giá chất lƣợng của phân bón vi sinh dạng hạt
Tỉ lệ trƣơng nƣớc: Hạt phân bón khô được ngâm trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.85%, pH 7) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và tỉ lệ trương nước (PS) được xác định bằng tỉ lệ khối lượng sau khi trương lên so với khối lượng hạt ban đầu theo công thức sau:
PS = 100(Ws Wd)/Wd
Tốc độ giải phóng VSV: 1g hạt phân bón khô được ngâm trong 100 ml nước muối sinh lý khử trùng trong vòng 1 tuần, khuấy từ nhẹ để xác định tốc độ giải phóng VSV. Lượng tế bào VSV giải phóng vào dung dịch nước muối được xác đính
au 1, 2 và 7 ngày. Trong thí nghiệm này, mật độ B.megaterium được xác định bằng
kĩ thuật đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch LB bổ sung L-tryptophan theo TCVN 10784:2015 [3].
Thời gian bảo quản: Các hạt phân bón khô được đóng gói trong túi PE tráng kẽm, và giữ trong phòng sạch. Sau 7, 30, 90 và 180 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ sống của VSV trong hạt phân bón được đánh giá theo quy trình sau: (1) 1g hạt phân bón khô, ngâm trong 10 ml dung dịch nước muối sinh lý trong 30 phút cho trương nở; (2) Các hạt sau khi hút no nước, được chuyển qua 100 ml dung dịch 10% sodium tricitrat trong 30 phút và lắc nhẹ; (3) Nồng độ VSV trong dung dịch được đánh giá bằng phương pháp cấy trải đếm khuẩn lạc trên thạch LB, ủ 37°C trong 48 giờ.
2.4.5. Đánh giá ảnh hƣởng của phân bón VSV đối với cây rau
Cây rau khảo sát được trồng và chăm sóc theo quy trình của địa phương từ tháng 8/2018 đến tháng 3/2019, tùy từng loại cây. Các cây non được trồng trong vườn ươm trước khi được chyển sang trồng ngoài đồng ruộng. Cây con có 3-5 lá thật được trồng thủ công trên ruộng thí nghiệm, vào các lỗ đã được bón lót bằng phân chuồng và NPK theo quy định, và được bổ sung khoảng 20-25 hạt (~ 1,0 gam) phân bón vi sinh. Mật độ trồng từ 30-35.000 cây/ha theo từng loại cây. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến cây rau được xác định đối với cây trồng trên đất phù sa tại các huyện Phúc Thọ và Hoài Đức, Hà Nội. Trong nghiên cứu này, công thức
đối chứng áp dụng nền NPK gồm phân cuồng và 120 kg N, 60 kg P2O5 và 80 kg
K2O cho mỗi ha; Thí nghiệm 1: Phân chuồng + 100% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha;
Thí nghiệm 2: Phân chuồng + 80% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha. Một số chỉ tiêu nông học của cây trồng được theo dõi và so sánh để đánh giá hiệu quả của phân vi sinh tạo được [27].
Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, và số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL và IRRISTAT 5.1.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium
VACC 118 và đánh giá chất lƣợng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt.
3.1.1. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118thích hợp 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá
trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Trong sản xuất công nghiệp, môi trường lên men tốt giúp đảm bảo đủ dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt. Dù King B là loại môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh IAA [8], song thành phần của môi trường này tương đối phức tạp, hầu hết thuộc loại hóa chất phải nhập khẩu, rất đắt tiền nên không thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp nên quá trình lựa chọn môi trường phù hợp để sản xuất quy mô lớn là hết sức cần thiết.
Trong thí nghiệm này, môi trường King B cùng với hai loại môi trường dùng trong lên men sản xuất thu dịch vi sinh là môi trường nước chiết đậu và SX BA đã được sử dụng. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào cũng được khảo sát và kết quả được trình bày trên Bảng 7.
Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của B.megaterium VACC 118
Môi trƣờng lên men Thời gian lên men
(giờ) King B (CFU/ml) Chiết đậu (CFU/ml) SX BA (CFU/ml) 0 giờ (2,90±0,45) x104 (4,00±0,34) x104 (2,80±0,44) x 104 48 giờ (2,00±0,30) x108 (3,70±0,25) x 108 (1,20±0,38) x 108 72 giờ (2,60±0,22) x107 (5,30±0,22) x 107 (2,40±0,33) x 107
Số liệu tại Bảng 7 cho thấy, chủng vi khuẩn B.megaterium VACC 118 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, mật độ tế bào trong
dịch lên men đạt mức cao hơn so với hai môi trường còn lại với 3.70 x 108 CFU/ml
dịch lên men sau 48h nuôi. Kết quả khảo sát cũng chỉ ra rằng, thời gian nuôi lý tưởng là 48h vì tại đây mức sinh khối VSV đạt cao nhất và có thể quần thể VSV đang ở pha cân bằng. Khi thời gian nuôi tăng lên 72h, nồng độ VSV bị giảm rõ rệt, chứng tỏ VSV lên men đã chuyển qua pha suy vong.
Trên cơ sở kết quả thu được, có thể nhận xét rằng chủng B.megaterium
VACC 118 phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, và thời gian nuôi cấy 48h được áp dụng như điều kiện tiên quyết để thực hiện tiếp các khảo sát điều kiện lên men của B.megaterium VACC 118.
3.1.1.2.Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion. Những biến đổi về nồng độ của chúng dù nhỏ cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp thu, trao đổi chất của vi sinh vật [53]. Trong thí nghiệm này, sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn sinh IAA được khảo sát trên môi trường nước chiết đậu ở các pH khác nhau, kết quả được trình bày trong Bảng 8.
Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của B.megaterium VACC 118.
pH môi trƣờng Thời gian pH 6,0 (CFU/ml) pH6,5 (CFU/ml) pH7,0 (CFU/ml) pH7,5 (CFU/ml) 48 giờ (3,80±0,25) x 10 7 (9,10±0,20) x 107 (7,50±0,21) x 108 (3,70±0,26) x 108 72 giờ (2,60±0,11) x 10 6 (4,70±0,28) x 107 (2,90±0,18) x 107 (2,50±0,18) x 107
Kết quả Bảng 8 cho thấy: vùng pH môi trường thích hợp nhất cho
B.megaterium VACC 118 phát triển là 7,0, tại pH môi trường này chủng vi khuẩn
nghiên cứu đạt mật độ tế bào cao khoảng 7.50 x 108 CFU/ml dịch lên men. Cũng
như các khảo sát bên trên thì sau 72h tại các pH khác nhau nhưng mật độ tế bào VSV cũng có xu hướng giảm so với tại thời điểm 48h.
Từ kết quả thu được Bảng 8 chúng tôi sử dụng pH môi trường lên men là 7,0 – là môi trường cho hiệu quả sinh trưởng B.megaterium tốt nhất, để tiếp tục tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
3.1.1.3.Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men tối ưu, chúng tôi khảo sát dải nhiệt độ từ 25°C đến 35°C. Các yếu tố khác của quá trình lên men giữ không thay đổi bao gồm: môi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH môi trường = 7.0, tốc độ sục khí 0.75 lít không khí /lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 9.
Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên quá trình sinh trưởng và
phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Nhiệt độ môi trƣờng (oC) 25 oC 30oC 35oC Mật độ (CFU/ml) (1,30±0,25) x 10 8 (5,20±0,18) x 108 (5,40±0,12) x 107
Từ kết quả thu được Bảng 9 cho thấy. Chủng B.megaterium VACC 118 phát
triển trong toàn bộ dải nhiệt độ đã khảo sát, tuy nhiên 30°C là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men thu sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu sử dụng nhiệt độ lên men ở 30°C để tiếp tục đánh giá các thông số lên men còn lại.
3.1.1.4.Đánh giá ảnh hƣởng của lƣu lƣợng cấp khí và tốc độ khuấy lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men hiệu quả, chúng tôi khảo sát dải cấp khí cho lên men từ 0.55-0.85 lít thông khí/lít môi trường/phút. Các yếu tố khác của quá trình lên men giữ không thay đổi bao gồm: môi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH môi trường = 7.0, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỉ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Sau khi thực nghiệm, kết quả đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng không khí cấp đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 10.
Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Lƣợng khí cấp (lít không khí/lít MT/phút) Mật độ tế bào (CFU/ml) 0,55 (2,4±0,25)x106 0,65 (1,5±0,12)x108 0,75 (5,3±0,17)x108 0,85 (2,5±0,25)x108
Kết quả cho thấy khi lượng không khí cung cấp trong quá trình lên men ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu quả lên men VSV. Khi lượng cấp khí quá thấp (khoảng 0,55 lít thông khí/ lít môi trường/ phút), cũng đồng nghĩa với lượng oxy hòa tan