B.megaterium VACC 118 sau khi được hoạt hóa trên King B, sẽ được chuyển qua len men trên môi trường nước chiết đậu ở 30ºC trong 5 ngày để tạo bào tử. Dung dịch được thu khi quá trình lên men đạt tới pha cân bằng. Nồng độ dịch vi sinh sẽ được cô đặc nhờ ly tâm 3000 rpm, để đạt nồng độ khoảng 1011 CFU/ml trước khi được sử dụng để tạo hạt phân bón.
Tinh bột biến tính được chuẩn bị từ tinh bột sắn thương mại đem chiếu xạ gamma với liều chiếu 3,5 kGy [1] được phối trộn cùng dung dịch sodium alginate đã khử trùng với tỉ lệ 2% sodium alginate và 33% tinh bột biến tính để thu được dung dịch tinh bột – alginate (SA). Tiếp tục phối trộn dung dịch lên men
B.megaterium đã cô đặc ở trên với dung dịch SA theo tỉ lệ 1:2, sau đó hỗn hợp được
nhỏ tạo hạt vào bể chứa dung dịch 2% CaCl2 tiệt trùng kèm khuấy từ để thu được
các hạt kết tủa (Hình 2).
Hình 2. Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón
Sau khi tạo hạt, tiếp tục khuấy nhẹ trong 30 phút để khâu mạch, đảm bảo tính ổn định của các hạt được tạo thành. Sau khi kết thúc khuấy, các hạt phân bón ẩm được thu gom, rửa một vài lần bằng nước cất để loải bỏ các ion kiềm còn dư trước khi làm khô. Hạt phân bón ẩm được làm khô ở nhiệt độ 38±2ºC đến độ ẩm dưới 10% và đóng gói vào túi thiếc để bảo quản cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3). Toàn bộ quá trình tạo hạt và làm khô được thực hiện trong tủ an toàn sinh học để hạn chế tối đa việc nhiễm tạp.
Hình 3. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt
2.4.4. Đánh giá chất lƣợng của phân bón vi sinh dạng hạt
Tỉ lệ trƣơng nƣớc: Hạt phân bón khô được ngâm trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.85%, pH 7) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và tỉ lệ trương nước (PS) được xác định bằng tỉ lệ khối lượng sau khi trương lên so với khối lượng hạt ban đầu theo công thức sau:
PS = 100(Ws Wd)/Wd
Tốc độ giải phóng VSV: 1g hạt phân bón khô được ngâm trong 100 ml nước muối sinh lý khử trùng trong vòng 1 tuần, khuấy từ nhẹ để xác định tốc độ giải phóng VSV. Lượng tế bào VSV giải phóng vào dung dịch nước muối được xác đính
au 1, 2 và 7 ngày. Trong thí nghiệm này, mật độ B.megaterium được xác định bằng
kĩ thuật đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch LB bổ sung L-tryptophan theo TCVN 10784:2015 [3].
Thời gian bảo quản: Các hạt phân bón khô được đóng gói trong túi PE tráng kẽm, và giữ trong phòng sạch. Sau 7, 30, 90 và 180 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ sống của VSV trong hạt phân bón được đánh giá theo quy trình sau: (1) 1g hạt phân bón khô, ngâm trong 10 ml dung dịch nước muối sinh lý trong 30 phút cho trương nở; (2) Các hạt sau khi hút no nước, được chuyển qua 100 ml dung dịch 10% sodium tricitrat trong 30 phút và lắc nhẹ; (3) Nồng độ VSV trong dung dịch được đánh giá bằng phương pháp cấy trải đếm khuẩn lạc trên thạch LB, ủ 37°C trong 48 giờ.
2.4.5. Đánh giá ảnh hƣởng của phân bón VSV đối với cây rau
Cây rau khảo sát được trồng và chăm sóc theo quy trình của địa phương từ tháng 8/2018 đến tháng 3/2019, tùy từng loại cây. Các cây non được trồng trong vườn ươm trước khi được chyển sang trồng ngoài đồng ruộng. Cây con có 3-5 lá thật được trồng thủ công trên ruộng thí nghiệm, vào các lỗ đã được bón lót bằng phân chuồng và NPK theo quy định, và được bổ sung khoảng 20-25 hạt (~ 1,0 gam) phân bón vi sinh. Mật độ trồng từ 30-35.000 cây/ha theo từng loại cây. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến cây rau được xác định đối với cây trồng trên đất phù sa tại các huyện Phúc Thọ và Hoài Đức, Hà Nội. Trong nghiên cứu này, công thức
đối chứng áp dụng nền NPK gồm phân cuồng và 120 kg N, 60 kg P2O5 và 80 kg
K2O cho mỗi ha; Thí nghiệm 1: Phân chuồng + 100% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha;
Thí nghiệm 2: Phân chuồng + 80% NPK + 20 kg phân vi sinh/ha. Một số chỉ tiêu nông học của cây trồng được theo dõi và so sánh để đánh giá hiệu quả của phân vi sinh tạo được [27].
Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, và số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL và IRRISTAT 5.1.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium
VACC 118 và đánh giá chất lƣợng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt.
3.1.1. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118thích hợp 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá 3.1.1.1.Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá
trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Trong sản xuất công nghiệp, môi trường lên men tốt giúp đảm bảo đủ dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt. Dù King B là loại môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh IAA [8], song thành phần của môi trường này tương đối phức tạp, hầu hết thuộc loại hóa chất phải nhập khẩu, rất đắt tiền nên không thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp nên quá trình lựa chọn môi trường phù hợp để sản xuất quy mô lớn là hết sức cần thiết.
Trong thí nghiệm này, môi trường King B cùng với hai loại môi trường dùng trong lên men sản xuất thu dịch vi sinh là môi trường nước chiết đậu và SX BA đã được sử dụng. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào cũng được khảo sát và kết quả được trình bày trên Bảng 7.
Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của B.megaterium VACC 118
Môi trƣờng lên men Thời gian lên men
(giờ) King B (CFU/ml) Chiết đậu (CFU/ml) SX BA (CFU/ml) 0 giờ (2,90±0,45) x104 (4,00±0,34) x104 (2,80±0,44) x 104 48 giờ (2,00±0,30) x108 (3,70±0,25) x 108 (1,20±0,38) x 108 72 giờ (2,60±0,22) x107 (5,30±0,22) x 107 (2,40±0,33) x 107
Số liệu tại Bảng 7 cho thấy, chủng vi khuẩn B.megaterium VACC 118 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, mật độ tế bào trong
dịch lên men đạt mức cao hơn so với hai môi trường còn lại với 3.70 x 108 CFU/ml
dịch lên men sau 48h nuôi. Kết quả khảo sát cũng chỉ ra rằng, thời gian nuôi lý tưởng là 48h vì tại đây mức sinh khối VSV đạt cao nhất và có thể quần thể VSV đang ở pha cân bằng. Khi thời gian nuôi tăng lên 72h, nồng độ VSV bị giảm rõ rệt, chứng tỏ VSV lên men đã chuyển qua pha suy vong.
Trên cơ sở kết quả thu được, có thể nhận xét rằng chủng B.megaterium
VACC 118 phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, và thời gian nuôi cấy 48h được áp dụng như điều kiện tiên quyết để thực hiện tiếp các khảo sát điều kiện lên men của B.megaterium VACC 118.
3.1.1.2.Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion. Những biến đổi về nồng độ của chúng dù nhỏ cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp thu, trao đổi chất của vi sinh vật [53]. Trong thí nghiệm này, sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn sinh IAA được khảo sát trên môi trường nước chiết đậu ở các pH khác nhau, kết quả được trình bày trong Bảng 8.
Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của B.megaterium VACC 118.
pH môi trƣờng Thời gian pH 6,0 (CFU/ml) pH6,5 (CFU/ml) pH7,0 (CFU/ml) pH7,5 (CFU/ml) 48 giờ (3,80±0,25) x 10 7 (9,10±0,20) x 107 (7,50±0,21) x 108 (3,70±0,26) x 108 72 giờ (2,60±0,11) x 10 6 (4,70±0,28) x 107 (2,90±0,18) x 107 (2,50±0,18) x 107
Kết quả Bảng 8 cho thấy: vùng pH môi trường thích hợp nhất cho
B.megaterium VACC 118 phát triển là 7,0, tại pH môi trường này chủng vi khuẩn
nghiên cứu đạt mật độ tế bào cao khoảng 7.50 x 108 CFU/ml dịch lên men. Cũng
như các khảo sát bên trên thì sau 72h tại các pH khác nhau nhưng mật độ tế bào VSV cũng có xu hướng giảm so với tại thời điểm 48h.
Từ kết quả thu được Bảng 8 chúng tôi sử dụng pH môi trường lên men là 7,0 – là môi trường cho hiệu quả sinh trưởng B.megaterium tốt nhất, để tiếp tục tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
3.1.1.3.Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men tối ưu, chúng tôi khảo sát dải nhiệt độ từ 25°C đến 35°C. Các yếu tố khác của quá trình lên men giữ không thay đổi bao gồm: môi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH môi trường = 7.0, tốc độ sục khí 0.75 lít không khí /lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 9.
Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên quá trình sinh trưởng và
phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Nhiệt độ môi trƣờng (oC) 25 oC 30oC 35oC Mật độ (CFU/ml) (1,30±0,25) x 10 8 (5,20±0,18) x 108 (5,40±0,12) x 107
Từ kết quả thu được Bảng 9 cho thấy. Chủng B.megaterium VACC 118 phát
triển trong toàn bộ dải nhiệt độ đã khảo sát, tuy nhiên 30°C là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men thu sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu sử dụng nhiệt độ lên men ở 30°C để tiếp tục đánh giá các thông số lên men còn lại.
3.1.1.4.Đánh giá ảnh hƣởng của lƣu lƣợng cấp khí và tốc độ khuấy lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118
Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men hiệu quả, chúng tôi khảo sát dải cấp khí cho lên men từ 0.55-0.85 lít thông khí/lít môi trường/phút. Các yếu tố khác của quá trình lên men giữ không thay đổi bao gồm: môi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH môi trường = 7.0, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỉ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Sau khi thực nghiệm, kết quả đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng không khí cấp đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 10.
Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Lƣợng khí cấp (lít không khí/lít MT/phút) Mật độ tế bào (CFU/ml) 0,55 (2,4±0,25)x106 0,65 (1,5±0,12)x108 0,75 (5,3±0,17)x108 0,85 (2,5±0,25)x108
Kết quả cho thấy khi lượng không khí cung cấp trong quá trình lên men ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu quả lên men VSV. Khi lượng cấp khí quá thấp (khoảng 0,55 lít thông khí/ lít môi trường/ phút), cũng đồng nghĩa với lượng oxy hòa tan trong bể lên men ở mức thấp, sẽ khiến cho hiệu quả lên men giảm sút đáng kể, chỉ đạt 2,4×106
CFU/ml dịch nuôi sau 48h lên men. Khi lượng cấp khí đạt 0,75 lít không khí/môi trường/phút thì khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng nghiên cứu cao nhất với đạt 5,3×108 CFU/ml dịch nuôi sau 48h lên men. Tuy nhiên, khi lượng cấp khí trong môi trường tăng lên tới 0.85 lít không khí/môi trường/phút thì
tốc độ lên men của chủng B.megaterium khảo sát bị giảm. Điều này có thể giải thích
nhiều, gây ảnh hưởng tới hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của đối tượng nghiên cứu dẫn tới giảm hiệu suất lên men.
Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi chọn lưu lượng khí cấp 0,75 lít không khí/môi trường/phút để tiếp tục nghiên cứu các thông số lên men tiếp theo
Ngoài lưu lượng cấp khí, tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài tác dụng hoà đều lượng ôxy vào môi trường, quá trình khuấy trộn giúp các tế bào vi sinh vật có thể chuyển động, tạo điều kiện cho chúng có thể hấp thụ chất dinh dưỡng một cách dễ dàng. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sự gia tăng sinh khối của
B.megaterium VACC 118 được trình bày trong Bảng 11.
Bảng 11. Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Vận tốc cánh khuấy (vòng/phút) Mật độ tế bào (CFU/ml) 250 (1,8±0,33)x107 300 (4,8±0,24)x108 350 (3,2±0,28)x108 400 (2,6±0,35)x108
Như chỉ ra trên Bảng 11, mật độ tế bào của chủng vi khuẩn khảo sát đạt cao nhất khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 300 vòng/phút, mật độ tế bào vi khuẩn đạt 4,8x108 CFU/ml. Tại các mức độ tốc độ khuấy thấp hơn hoặc nhanh hơn hiệu quả lên men đều không cao, điều này có thể do tốc độ khuấy chậm sẽ hạn
chế khả năng hoà tan O2 trong không khí vào môi trường làm giảm hiệu quả hô hấp
tế bào, tuy nhiên tốc độ khuấy quá cao sẽ cản trở vi sinh vật hấp thụ chất dinh dưỡng của VSV.
Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi chọn tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 300 vòng/phút để tiếp tục nghiên cứu các thông số lên men tiếp theo
3.1.1.5.Đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ tiếp giống đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.
Trong kỹ thuật lên men hiện đại, ngoài các yếu tố về môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy thì lượng giống cấp 1 bổ sung vào quá trình lên men hết sức quan trọng, nó quyết định chất lượng và giá thành của sản phẩm. Nghiên cứu đưa ra một tỷ lệ giống cấp 1 thích hợp trong quá trình lên men là rất cần thiết. Sau khi khảo sát, kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 12.
Bảng 12. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 1 đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA
Nồng độ giống cấp 1 (%) 3% 5% 7% Mật độ tế bào (CFU/ml) (6,30±0,25) x 10 8 (7,65±0,22) x 108 (6,90±0,38) x 108
Kết quả Bảng 12 cho thấy, khi lượng giống cấp 1 bổ sung vào là 3% thì mật
độ tế bào trong dịch lên men đều đạt trên 108 CFU/ml. Tuy nhiên, khi bổ sung 5%
hoặc 7% mật độ tế bào đạt được cao hơn không nhiều so với khi bổ sung 3%. Kết quả trên cho thấy, để tiết kiệm chi phí sản xuất thì lượng giống cấp I được bổ sung vào 3% là thích hợp nhất cho quá trình lên men các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Kết luận: Sau các thí nghiệm để tối ưu để lên men B. megaterium VACC 118, chúng tôi đã lựa chọn được một quy trình tối ưu như sau: môi trường lên men phù hợp là nước chiết đậu pH = 7,0, tỷ lệ cấp giống cấp 1 là 3%, nhiệt độ môi
trường lên men (tº = 30°C), lượng khí cấp 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, thời gian lên men 48 giờ.
3.1.2. Đánh giá chất lƣợng phân bón vi sinh dạng hạt
Phân vi sinh vật dạng hạt chứa các bào tử B.megaterium đã được tạo ra theo
quy trình mô tả trong Hình 2 và chất lượng sản phẩm phân bón được đánh giá thông qua các chỉ tiêu kỹ thuật như trình bày trong Bảng 13. Rõ ràng là, phân bón vi sinh vật dạng hạt được tạo ra đáp ứng toàn bộ các yêu cầu hiện hành về pH, độ ẩm, mật độ tế bào và độ tạp nhiễm. Đặc biệt là mật độ tế bào VSV hữu ích trong phân bón
VSV dạng hạt đạt 4,341010 CFU/g, cao hơn nhiều so với quy định hiện hành (chỉ