Khuếch đại ADN (PCR)

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.7. Khuếch đại ADN (PCR)

Một đoạn ADN bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

hợp in-vitro sử dụng ADN polymerase và các oligonucleotide (các mồi – primers). Đó chính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR. Nhờ phản ứng này, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được dùng làm mồi để tổng hợp ADN invitro nhờ enzym ADN polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng ADN khuôn ban đầu rất nhỏ (cỡ 10-3

µg) [11]

Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ phản ứng đòi hỏi ba bước. Đầu tiên ADN khuôn được xử lý nhiệt độ gây biến tính thành hai sợi đơn. Bước tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống cho phép các mồi (số lượng rất lớn) liên kết tạo cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn (do số lượng mồi lớn nên liên kết giữa mồi và ADN khuôn xảy ra chiếm ưu thế so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn). Trong bước thứ ba, hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Khi các chu kỳ được lặp lại, các đoạn ADN vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn mẫu cho chu kỳ sau. Số lượng phân tử ADN tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Chỉ sau vài chu kỳ đầu, sản phẩm tạo ra chủ yếu là các đoạn ADN có kích thước bằng đúng khoảng cách giữa hai mồi. [11]

Cả hai sợi ADN đều đuợc dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia. Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

được tổng hợp, các sợi này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n

bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn tới kết quả là một đoạn ADN định trước được “nhân lên”.[5]

Phản ứng nhân gen (PCR): Trong thực tế số lượng chu kỳ của một phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ, vì phản ứng PCR diễn ra 2 giai đoạn: Giai đoạn đầu: số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu bản đầu, giai đoạn sau hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do phân hủy, cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế, các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với các mồi mà lại bắt cặp với nhau.

Số chu kỳ phụ thuộc vào lượng mẫu ban đầu: Lượng ADN khuôn là 105

thì

cần đến 30 chu kỳ, lượng ADN khuôn là 102

- 103 thì số chu kỳ phải là 35 đến 40 chu kỳ. Tiến hành trên máy nhân gen. Sản phẩm PCR được bảo quản ở -200

C.[4]

Trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tăng cường hiệu quả PCR đối với những mẫu chất lượng kém có chứa ADN. Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để PCR thành công ADN thu được từ những mẫu có chất lượng kém là tăng số chu kỳ PCR. Quy trình này đã được phát triển tại Trung tâm khoa học hình sự ở Anh (và đã được thực nghiệm thành công bởi các phòng thí nghiệm khác), thường gọi là phân tích Low Copy Number (LCN) [12]. Đối với kỹ thuật LCN này số chu kì sử dụng trong PCR các locus của STR là 34, có khả năng cho phép tăng sản phẩm lên hơn 3 tỉ bản copies, so với phản ứng chuẩn là 28 chu kỳ. Tăng số chu kỳ cũng thường được sử dụng trong nghiên cứu và giám định ADN từ những mẫu vật có niên đại lớn như hài cốt người, có thể tăng lên tới 60 chu kỳ để đạt mức tối đa sự thành công trong phản ứng PCR [13].

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

Trong mô tả ban đầu về LCN, để thu được một kiểu gen hoàn chỉnh chỉ cần từ 5 đến 10 tế bào (30 đến 60 pg) và tăng đáng kể chiều cao peak trong điện di [12]. Kloosterman và Kersbergen sử dụng phương pháp khác, thêm Taq polymerase chạy 28 chu kỳ và chu trình nhiệt cũng được tăng thêm 6 chu kỳ [14]. Mặc dù hầu hết các bộ kit PCR cũ thường có 28 chu kỳ, do đó các bộ kit thương mại mới đang tận dụng sự thành công của việc tăng số chu kỳ PCR, như bộ kit Minifiler của hãng Applied Biosystem (Mỹ) với 29 chu kỳ, Yfiler (30 chu kỳ), NGM (29 chu kỳ), Promega’s ESX và ESI (30 chu kỳ) và mới nhất hiện nay là bộ kit Identifiler plus (29 chu kỳ). Tuy nhiên việc tăng chu kỳ phản ứng PCR cũng mang đến một số yêu cầu về phòng chống nhiễm vì nó có khả năng gây nhiễm thường xuyên hơn, có thể các đoạn ADN ngắn cũng được nhân lên và làm ảnh hưởng đến kết quả điện di. Phát triển mồi cho khuếch đại locus STR trong các thành phẩm thương mại đã được cải thiện. Trong khi phần lớn các bộ kít vẫn sử dụng mồi ban đầu, Butler và các đồng nghiệp đã thiết kế lại khuôn ADN nhỏ hơn để sản xuất ra “mini-STRs”, sản xuất các mồi mà có tỷ lệ thành công cao đáng kể với ADN đã bị phân hủy. Kết quả nghiên cứu này tạo ra khuôn ADN nhỏ hơn được sử dụng để tạo ra bộ kít MiniFiler STR (hãng ABI) trong đó có tỉ lệ thành công cao hơn đáng kể so với ADN bị phân hủy hoặc ADN bị ức chế so với các bộ kít tiêu chuẩn, nhưng cũng có một yêu cầu lượng ADN đầu vào thấp là 0,125 ng so với 0,5 ng. Ngoài việc thay đổi các điều kiện chu kỳ hoặc trình tự mồi, các thành phần của master-mix, việc giảm thể tích PCR có thể có tác động hiệu quả nhất. Gaines và cộng sự đã đưa ra báo cáo rằng khả năng PCR thành công tăng gấp 4 lần khi giảm thể tích PCR xuống còn 5 µl [15]. Tuy nhiên, chỉ đơn giản giảm thể tích PCR có thể không tăng hiệu quả hoặc độ chính xác, nó chỉ có thể đơn giản là làm tăng nồng độ tương đối của các mẫu với thành phần phản ứng.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

Thay đổi các thành phần cụ thể (như là MgCl2, mồi hoặc nồng độ đệm) trong các sản phẩm thương mại đa hệ STR là không thể, do cách chúng đã được chuẩn bị. Có một số ý kiến cho rằng thay đổi công thức đệm hoặc nồng độ mồi có thể cải thiện khả năng khuếch đại thành công đối với loại mẫu kém chất lượng, mặc dù vẫn chưa được kiểm tra với các STR hiện hành. Tuy nhiên, việc thay đổi các loại ADN polymerase đã được chứng minh là làm tăng đáng kể độ nhạy và hiệu quả của phản ứng, giúp tăng hiệu quả với mẫu có lượng tế bào chứa ADN rất nhỏ hoặc mẫu có chứa nhiều chất ức chế.

Phương pháp tinh sạch sản phẩm sau khi PCR thường được sử dụng là loại bỏ muối, ion và các dNTP chưa sử dụng và mồi dư thừa sau phản ứng sử dụng lọc (ví dụ: cột lọc Microcon), màng silica gel (ví dụ, cột Qiagen MinElute), hoặc enzyme thủy phân (ví dụ: ExoSAP-IT). Tinh sạch các ion âm như Cl- để ngăn chặn cạnh tranh phân tử diễn ra trong quá trình hút mẫu chạy điện di, đảm bảo tối đa lượng ADN được đưa vào. Tinh sạch bằng cột MinElute đã cho tăng gấp bốn lần chiều cao peak.[16]

Trong quá trình tinh sạch thì cũng có thể cô đặc sản phẩm PCR. Giảm số lượng sản phẩm PCR từ 50-25 µl xuống 10 µl có thể làm tăng 6 đến 14 lần chiều cao peak. Nếu toàn bộ sản phẩm PCR được giảm xuống xấp xỉ 1 µl cho chiều cao peak còn tăng hơn nữa.[16]

1.8. Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lƣợng ADN

Mặc dù tất cả các lựa chọn ở trên để cải thiện hiệu quả PCR và xác định chính xác dấu vết ADN ghi thu tại hiện trường vụ án hình sự, rất nhiều phòng thí nghiệm hình sự đã miễn cưỡng sử dụng các phương pháp đó trong quy trình giám định. Không sản phẩm thương mại nào được xác nhận bởi nhà sản xuất cho việc tăng lên 34 chu kỳ cho phản ứng PCR. Nguyên nhân chính để các nhà khoa học hình sự sử dụng việc tăng chu kỳ là để thu được kiểu gen hoàn chỉnh. Bốn trường hợp có thể xảy ra khi PCR đối với ADN tách chiết từ dấu vết máu có chất lượng kém như dấu vết trên vải đã bị giặt:

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

a. Alen bị drop-out (mất alen), hiện tượng mất alen trong locus dị hợp tử. b. Giảm sự cần bằng alen dị hợp tử trong 1 locus hoặc giữa locus, gây ra sự mất cân bằng nghiêm trọng độ cao peak trong và giữa các locus.

c. Alen bị drop-in (thêm alen), do hình ảnh khuếch đại tạo ra như stutter (alen lặp) dẫn tới khó khăn trong việc mô tả số lượng người cho với kiểu gen phân tích được và sự ấn định của các alen trong 1 hỗn hợp.

d. Alen bị drop-in (thêm alen), gây ra bởi sự nhiễm không thường xuyên từ hiện trường vụ án hoặc phòng thí nghiệm. Mặc dù xác suất của alen drop-in vẫn giữ nguyên, không phụ thuộc vào số lượng mẫu. Ngoài ra, phụ thuộc vào khi các nguồn gây nhiễm vào một mẫu, việc phân tích lại có thể hoặc không thể tái tạo các kết quả ban đầu.

Hiện tại chưa có phương pháp hoàn chỉnh nào để loại trừ những chất ức chế gây ra trong quá trình PCR, ADN gây ảnh hưởng tới hình ảnh điện di phân tích kết quả. Một kết quả điện di của ADN thu được từ dấu vết máu có hiện tượng mất alen, alen lặp, thêm alen gây khó khăn trong việc phân tích, đối chiếu so sánh kết quả tìm ra chứng cứ, truy nguyên cá thể có mức độ tin cậy cao.

1.9. Kỹ thuật điện di

1.9.1. Nguyên lý của kỹ thuật điện di

Dưới ảnh hưởng của điện trường trong đệm có pH nhất định, các phân tử và các hạt mang điện tích sẽ chuyển động về phía điện cực trái dấu. Phân tử ADN tích điện âm nên sẽ chuyển động về phía cực dương. Trong quá trình điện di do có điện tích và khối lượng khác nhau, những phân tử và những hạt trong một hỗn hợp sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và phân tách thành những tiểu phần khác nhau. Những đoạn ADN có kích thước khác nhau cũng sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau trong điện trường. Để xác định được vị trí các băng ADN sau khi điện di người ta có thể sử dụng các phương pháp phát hiện khác nhau: nhuộm bằng ethidium bromide, nhuộm bạc, đánh dấu phóng xạ, gắn huỳnh quang…

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

1.9.2. Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer

Đây là phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản). Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang. Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange) tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.

Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm để xác định các alen của mỗi locus.

1.10. Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn

Dấu vết ADN khi bị lẫn làm tăng phần phức tạp trong việc giải thích, phân tích dấu vết. Dấu vết ADN lẫn trong các vụ án hình sự có thể bao gồm ADN của một hoặc nhiều người để lại, mức độ lẫn là khác nhau giữa mỗi người, người để lại nhiều dấu vết, người để lại ít dấu vết. Ngoài ra các mẫu lẫn có thể bao gồm ADN của nhiều người nhưng đều chỉ ở mức độ lượng ít. Kiểu gen thu được thực sự bắt nguồn từ một nguồn duy nhất có thể bị xử lý như là một mẫu lẫn khi đỉnh của stutter (alen lặp) cao và do đó dẫn tới giải thích sai vì coi mẫu đó bắt nguồn từ nhiều cá thể. Với xác suất cao của alen bị mất đi hoặc bị lặp lại, việc xác định số lượng người để lại tế bào chứa ADN trong mẫu lẫn là một vấn đề khó khăn. Tăng cường phản ứng khuếch đại có thể làm cho alen trong kiểu gen phân tích được ít bị mất đi hoàn toàn ở một

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

vài locus hoặc có thể gây ra sự khuếch đại thêm một số alen, tạo ra sự xuất hiện kiểu gen của một người khác riêng biệt. Đặc biệt, việc tăng stutter (alen lặp) nhìn thấy được khi thực hiện phản ứng khuếch đại ADN từ dấu vết máu gây ra một vấn đề cực kì khó khăn cho việc phân tích mẫu lẫn. Mặc dù có những hướng dẫn tỷ lệ phần trăm stutter (alen lặp) ở những locus cụ thể cho một lượng mẫu tiêu chuẩn nhưng không có tiêu chuẩn nào cho mẫu ADN có chất lượng kém.

Để biện luận kết quả và đưa ra kết luận cho trường hợp mẫu lẫn phải sử dụng Tỉ lệ khả dĩ (Likelihood Ratio-LR).

LR = Hp/Hd trong đó Hp : Mẫu lẫn ở hiện trường (lẫn giữa ADN của đối tượng và ADN của một người chưa biết).

Hd : Mẫu ở hiện trường (lẫn giữa ADN của hai người chưa biết).

Ngoài ra, ta còn có thể phân biệt các nguồn ADN khác nhau bằng độ đậm nhạt của các vạch trên ADN của bản gel hoặc độ cao thấp của các peak nếu điện di trên các máy hiện đại và từ đó truy nguyên đồng nhất như trường hợp mẫu không lẫn gen. Phương pháp này đuợc gọi là semi intutive. Tuy nhiên, phải rất cẩn trọng khi sử dụng phương pháp này.

1.11. Vấn đề nhiễm ADN

Việc nhiễm nguồn gen là một vấn đề rất quan trọng cần chú ý trong việc phân tích và giải thích ADN có số lượng ít. ADN nhiễm vào mẫu có thể nhiều hay ít, hoặc nhiều hơn ADN gốc. Theo lý thuyết, bất kỳ ADN nào sót lại ở hiện trường không phải ngay lập tức có liên quan đến tội phạm đang được điều tra, có thể được xem như là ADN nhiễm. Việc nhiễm ADN có thể xuất hiện ở bất kỳ trường hợp nào sau đây:

(1) trước khi hành động tội phạm xảy ra;

(2) trong khoảng thời gian giữa hành động phạm tội và bảo vệ hiện trường vụ án;

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

(3) trong quá trình khám nghiệm hiện trường; (4) trong phòng thí nghiệm.

Để giảm thiểu nguy cơ nhiễm ADN ở hiện trường vụ án, cần thực hiện nghiêm ngặt các điều sau đây:

a. Hạn chế thâm nhập nhiều vào nơi có khả năng có dấu vết;

b. Sử dụng găng tay, khẩu trang, xem xét chặt chẽ những mẫu vật có liên quan đến tội phạm;

c. Thay đổi thường xuyên găng tay khi thu thập tang vật bị tiếp xúc; d. Tránh một cách tối đa chạm vào khu vực mà có thể thu được dấu vết

Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra