Phương pháp PCR

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.6. Phương pháp PCR

Trong khuôn khổ luận văn, các mẫu tách chiết được PCR bằng bộ kit Identifiler của hãng ABI - Mỹ là một bộ kit thương phẩm dùng cho giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự. Bộ kit nhân bội đồng thời 15 locus gen STR và 1 locus gen giới tính. Các locus gen STR trong bộ kit này: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA và Amelogenin.

Bảng 1.1. Thành phần và thể tích phản ứng PCR

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (kit Identifiler Direct) 95oC: 11 phút 94oC: 20 giây 59oC: 2 phút 72: 1 phút 60oC: 25 phút 4oC: ∞

2.3.7. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis - CE)

Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi

Thành phần Thể tích

AmpFlSTR® Identifiler® Direct Master

Mix

7.5 µl AmpFlSTR® Identifiler® Direct Primer

Set

7.5 µl

Mẫu 1-5 µl

Tổng 16-20 µl

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

là điện di mao quản) trên máy giải trình tự gen 3130 của hãng Applied Biosystems. Hiện Viện Khoa học hình sự đã được trang bị máy điện di mao dẫn có 04 và 16 mao quản. Sau quá trình điện di, các kết quả thu được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID v3.2 để xác định các alen của mỗi locus.

Bảng 1.2: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản

Thành phần Thể tích

Hi-DiTM Formamide 8,7 µl

GeneScanTM 500 LIZ ® 0,3 µl

Mẫu (Thang alen) 1,5 µl

Tổng 10,5 µl

Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng như bảng 1.2.

Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95oC trong vòng 3 - 5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết ADN từ dạng mạch đôi sẽ chuyển sang dạng mạch đơn hoàn toàn. Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu đều dựa trên các nguyên tắc khoa học, ứng dụng các thành tựu nghiên cứu tiên tiến do đó luôn đảm bảo tính chính xác, khách quan khoa học.

2.4. Thiết kế bố trí thí nghiệm

2.4.1. Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra

Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng và số lƣợng của dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng:

- Loại xà phòng dùng để giặt.

- Cách thức giặt, phơi bao gồm: Thời gian giặt, thời gian ngâm xà phòng, dụng cụ giặt như giặt tay, giặt máy, giặt tay nhưng dùng bàn chải để chà, nhiệt độ của nước giặt, phơi trong nhà hay ngoài trời, nhiệt độ phơi...

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

- Lượng dấu vết bám trên vật mang.

- Thời gian dấu vết máu tồn tại trên vật mang trước khi bị giặt. - Chất liệu vải, màu sắc của vải.

Đề tài chỉ nghiên cứu biến động của những yếu tố mà chúng tôi cho là cần thiết và có ý nghĩa phục vụ công tác giám định đó là các yếu tố sau:

+ Loại xà phòng dùng để giặt: Sử dụng 3 loại bột giặt đó là bột giặt Ô mô, bột giặt Tide và bột giặt Ariel là 3 loại bột giặt thông dụng nhất trên thị trường hiện nay tại Việt Nam.

+ Cách thức giặt phơi: Không tiến hành khảo sát tất cả những biến động của yếu tố này vì trên thực tế cũng rất đa dạng và không thể xác định được thủ phạm đã giặt như thế nào nên chúng tôi chỉ đưa ra hai cách giặt thông thường nhất đó là giặt tay vàgiặt máy, dùng nước máy sạch và nhiệt độ của nước giặt là nhiệt độ tự nhiên phù hợp với thời tiết ở Việt Nam vào mùa hè đó là khoảng 250C đến 300C, phơi ở điều kiện nắng gió bình thường và nhiệt độ là khoảng 250

C đến 350C. Sử dụng bột giặt ô mô loại giặt tay (sản xuất tại công ty TNHH Quốc tế Unilever Việt Nam, theo công nghệ của Hà Lan là loại bột giặt thông dụng nhất hiện nay tại Việt Nam), dùng bột giặt ô mô cho máy giặt cửa đứng (sản xuất tại công ty TNHH Quốc tế Unilever Việt Nam, theo công nghệ của Hà Lan là loại bột giặt thông dụng nhất hiện nay tại Việt Nam). Ngoài ra còn khảo sát thêm hai loại xà phòng nữa là bột giặt Tide dùng chung cho cả tay và máy sản phẩm của công ty TNHH Procter Gamble Việt Nam và nước giặt Ariel dùng chung cho cả tay lẫn máy sản phẩm của công ty TNHH Procter Gamble sản xuất tại Malaysia cũng là hai loại xà phòng thông dụng hiện nay tại Việt Nam.

+ Lượng dấu vết bám trên vật mang: Sử dụng lượng máu là 3 ml và 0,5 ml tạo dấu vết trên vải.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

+ Thời gian dấu vết máu tồn tại trên vật mang trước khi bị giặt: Giặt sau khi được tạo mẫu và để khô ở nhiệt độ phòng 24 giờ và giặt sau khi được tạo mẫu và để khô ở nhiệt độ phòng 72 giờ.

+ Chất liệu vải, màu sắc của vải: Sử dụng loại vải mỏng mềm chất liệu polyeste chiếm 90% và loại chất vải dày cứng chất liệu cotton chiếm 90%. Sử dụng 3 mảnh vải cùng chất liệu nhưng khác nhau về màu sắc đó là trắng, đen, đỏ.

Các mẫu khảo nghiệm đƣợc tạo ra: Tổng số mẫu là 16 mẫu (mỗi mẫu sẽ đƣợc tách chiết bằng 2 phƣơng pháp): đƣợc chia làm 6 nhóm (là các nhóm bị tác động) và nhóm 7 (là nhóm không bị tác động).

+ Nhóm 1: So sánh dấu vết được tạo ra trên vải và bị giặt bởi 3 loại xà phòng

khác nhau gồm 3 mẫu: 01 mẫu giặt bằng bột giặt Ô mô loại giặt tay (mẫu 1A) và 01 mẫu giặt bằng bột giặt Tide loại dùng cho cả giặt tay và giặt máy (mẫu 1B) và 01 mẫu giặt bằng nước giặt Ariel (mẫu 1C). Ba mẫu được tạo giống nhau và mỗi mẫu được tạo ra như sau:

Tạo mẫu:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15 cm x 15 cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều, để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. Cách giặt của nhóm 1 như sau:

- Đối với mẫu 1A: Dùng 10 gram bột giặt Ô mô loại giặt tay hòa tan với 0,5 lít nước máy sạch, sau đó cho mẫu máu đã được tạo ra trên mảnh vải vào, vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước xà phòng và cho sang một chậu nước máy sạch (dùng khoảng 5 lít nước) vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước. Lặp lại bước này 3 lần.

- Đối với mẫu 1B: Dùng 10 gram bột giặt Tide loại dùng chung cho cả giặt tay và giặt máy, hòa tan với 0,5 lít nước máy sạch, sau đó giặt giống mẫu 1A.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

- Đối với mẫu 1C: Dùng 10 gram nước giặt Ariel dùng chung cho cả tay lẫn máy hòa tan với 0,5 lít nước máy sạch, sau đó sau đó giặt giống mẫu 1A.

+ Nhóm 2: So sánh lượng dấu vết sau khi bị giặt tay và giặt máy gồm 02

mẫu: 01 mẫu giặt tay (mẫu 2A) và 01 mẫu giặt máy (mẫu 2B). Hai mẫu được tạo giống nhau và mỗi mẫu được tạo ra như sau:

- Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên 01 mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. (Một mẫu giặt tay và một mẫu giặt máy).

- Với 01 mẫu giặt bằng tay: Dùng 10 gram xà phòng bột ô mô hòa tan với 0,5 lít nước máy sạch, sau đó cho mẫu máu đã được tạo ra trên mảnh vải vào, vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước xà phòng và cho sang một chậu nước máy sạch (dùng khoảng 5 lít nước) vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước. Lặp lại bước này 3 lần.

- Với 01 mẫu giặt bằng máy: Sử dụng máy giặt LG cửa đứng, loại 7 kg, (loại máy giặt tương đối thông dụng có mức giá trung bình), dụng bột giặt ô mô dùng cho giặt máy và sử dụng nước máy sạch, cho mẫu máu đã được tạo ra trên mảnh vải vào cùng khoảng 4 kg quần áo. Sử dụng chế độ giặt bình thường với 50 gram xà phòng. (Số lượng xà phòng được dùng theo như hướng dẫn sử dụng xà phòng của nhà sản xuất).

+ Nhóm 3: So sánh lượng dấu vết bị giặt và được tạo ra theo hai cách nhiều ít

khác nhau trên một loại vải gồm 2 mẫu: - Tạo mẫu:

+ 01 mẫu (mẫu 3A) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 3ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

+ 01 mẫu (mẫu 3B) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 0,5 ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. Cách giặt của nhóm 3 như sau:

- Dùng 10 gram xà phòng bột ô mô loại giặt tay hòa tan với 0,5 lít nước máy sạch, sau đó cho mẫu máu đã được tạo ra trên mảnh vải vào, vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước xà phòng và cho sang một chậu nước máy sạch (dùng khoảng 5 lít nước) vò khoảng 1 phút, vắt kiệt nước. Lặp lại bước này 3 lần.

+ Nhóm 4: So sánh dấu vết bị giặt được tạo ra sau 24 giờ (mẫu 4A) và dấu

vết bị giặt được tạo ra sau 72 giờ (mẫu 4B). Tạo mẫu:

01 mẫu (mẫu 4A) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. 01 mẫu (mẫu 4B) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. Cách giặt của nhóm 4 giống nhóm 3.

+ Nhóm 5: So sánh dấu vết bị giặt được tạo ra trên ba mảnh vải có cùng chất

liệu chỉ khác nhau về màu sắc đó là một loại vải với 3 màu đen, đỏ, trắng

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

Tạo mẫu: Cả ba mẫu được tạo giống nhau và như sau: 01 mẫu (mẫu 5A) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu đen có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều, để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. 01 mẫu (mẫu 5B) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu đỏ có kích thước 15cm x 15cm, trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. 01 mẫu (mẫu 5C) được tạo ra như sau:

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ với lượng 1,5 ml lên một mảnh vải thô màu trắng có kích thước 15cm x 15cm trên một diện tích khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, sao cho lượng dấu vết được tạo trên vải là khá đồng đều. Để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. Cách giặt của nhóm 5 như sau:

Cả 3 mẫu trên được giặt bằng tay, giặt riêng cho từng mẫu và cách giặt của nhóm 5 giống nhóm 3.

+ Nhóm 6: So sánh lượng dấu vết bị giặt và được tạo ra trên hai loại vải một

loại vải mỏng mềm, chất liệu 90% polyeste, màu trắng và một loại vải dày cứng chất liệu 90% cottong màu trắng gồm 2 mẫu:

Tạo mẫu:

01mẫu được tạo ra như sau: (Mẫu 6A)

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ lên một mảnh vải có kích thước 15 cm x 15 cm (vải mỏng mềm, chất liệu 90% polyeste) sao cho dấu vết thấm đẫm trên một diện tích vải khoảng 4,5 cm x 4,5 cm, để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

01mẫu được tạo ra như sau: (Mẫu 6B)

Lấy mẫu máu tươi, dạng dịch lỏng (máu toàn phần) của người, nhỏ lên một mảnh vải có kích thước 15 cm x 15 cm (loại có chất vải dày cứng chất liệu cotton chiếm 90%) sao cho dấu vết thấm đẫm trên một diện tích vải khoảng 4,5cm x 4,5 cm để khô dấu vết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem giặt. Cách giặt của nhóm 6 giống nhóm 3.

+ Nhóm 7: Tạo hai mẫu:

01 mẫu (Mẫu 7A) được tạo ra giống như mẫu 6A nhưng không giặt (sử dụng

làm mẫu so sánh).

01 mẫu (Mẫu 7B) được tạo ra giống như mẫu 6B nhưng không giặt (sử dụng

làm mẫu so sánh).

Nguyên liệu:

+ Chuẩn bị khoảng 20 ml máu tươi toàn phần.

Sử dụng máu tươi toàn phần (không có chất chống đông và những thành phần khác không phải là máu) của một người lấy từ động mạnh.

+ Các loại vải như trên.

+ Chuẩn bị các loại xà phòng: Bột giặt ô mô loại giặt tay, bột giặt ô mô loại cho máy giặt cửa đứng (sản xuất tại công ty TNHH Quốc tế Unilever Việt Nam, theo công nghệ của Hà Lan), bột giặt Tide dùng chung cho cả tay và máy sản phẩm của công ty TNHH Procter Gamble Việt Nam và nước giặt Ariel dùng chung cho cả tay lẫn máy sản phẩm của công ty TNHH Procter Gamble sản xuât tại Malaysia.

+Nước máy sạch. +Máy giặt, chậu giặt.

2.4.2. Các mẫu tạo ra được ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B, được tiến hành các bước thí nghiệm như sau:

- Tiến hành thử định hướng và xác định tính đặc hiệu loài đối với tất cả các dấu vết thu được từ các mẫu khảo nghiệm.

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

- Tách chiết: Cắt chuyển dấu vết trên 16 mẫu có ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B các dấu vêt trên sẽ được cắt chuyển các diện tích vải bằng nhau có kích thước 1,2 cm x 1,2 cm cho vào các ống để tách chiết với hai phương pháp: Chelex 5% và bộ kít Prepfier với mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần vậy tổng số mẫu tách chiết sẽ là 96 mẫu.

- Định lượng: Tiến hành định lượng đối với 96 mẫu kể trên.

- PCR: Căn cứ vào kết quả định lượng và tính toán để tiến hành PCR các mẫu sao cho lượng ADN có được trong mỗi phản ứng là khoảng từ 0,5 ng.

- Chạy điện di và phân tích kết quả.

2.4.3. Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kít PrepFiler

Các mẫu được chia làm 2 mẻ mỗi mẻ 16 ống nghiệm. Mẻ 1 gồm 16 ống, mỗi ống nghiệm tách chiết ADN bằng phương pháp sử dụng 200 µl dung dịch chelex có nồng độ 5%. Mẻ 2 gồm 16 ống, mỗi ống nghiệm được