Tách dòng phân tử được thực h iê ̣n theo Sambrook và c s (2001) [21]. Sản phẩm PCR đươ ̣c tinh sạch theo GeneJET PCR Purification Kit và gắn vào vector tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Chọn dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình khuẩn la ̣c và bằng colony -PCR với că ̣p
mồi pUC18-F/pUC18-R (Bảng 2.2). Đoạn DNA đươ ̣c nhân bản từ colony -PCR dự kiến là 838 nucleotide.
(i) Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas thực hiện như sau: (1) Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% với sự có mặt của marker chuẩn và cắt lấy băng DNA quan tâm cho vào ống eppendorf 2ml. (2) Bổ sung Binding Buffer với gel đã cắt theo tỉ lệ 1:1, ủ ở 55 o
C trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn tạo dịch trong suốt. (3) Chuyển sản phẩm sang ống eppendorf màng lọc đáy (cột lọc tím), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây sau đó bỏ dịch đáy. (4) Bổ sung 700 µl Wash buffer, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. (5) Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf loại 1.5 ml, mở nắp trong vòng 5 phút. (6) Bổ sung 40 µl nước khử ion, ủ mẫu ở 55 o
C trong 5 phút, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. (7) Bỏ cột lọc, thu dịch đáy bảo quản. (8) Kiểm tra sản phẩm thôi gel bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mẫu đạt yêu cầu được bảo quản và sử dụng cho tách dòng phân tử. (ii) Tách dòng phân tử
Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector pBT được thể hiê ̣n ở bảng 2.4.
Hỗn hợp thu được từ phản ứng ligation được ủ ở 22oC trong khoảng 2 giờ, sau đó sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α
Sau khi thực hiện phản ứng ghép nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối gen GmCHI vào vector pBT STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 2 2 Buffer T4 ligase (10X) 1 3 Enzyme ligation 1 4 Vector pBT 1
5 Gen GmCHI (cDNA) 5
Tổng 10
Các bước được tiến hành như sau: (1) Tế bào khả biến được lấy từ tủ -85o
C và được để trong đá trong 20-30 phút. (2) Bổ sung 5 µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. (3) Hỗn hợp được đặt trong bình đá 15 phút, rồi ủ ở 42 oC chính xác 1 phút 30 giây, sau đó chuyển nhanh hỗn hợp vào đá lạnh (sốc nhiệt) trong 5- 10 phút. (4) Bổ sung 500 µl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) cho vào hỗn hợp. (5) Hỗn hợp được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37 oC trong 1 giờ.
Cấy trải tế bào biến nạp trên môi trường LB đặc
Đổ thạch môi trường cấy trải (X-gal: 50 µl; IPTG: 50 µl; carbenicillin: 50µl; LB đặc: 500µl) vào đĩa thủy tinh hoặc nhựa. LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose).
Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường môi trường cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 37 o
C trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng: Chọn các khuẩn lạc trắng đem nuôi
trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000 µl LB lỏng: 1 µl carbenicillin). Nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng /phút, trong 16 giờ.
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR: Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng colony- PCR với cặp mồi pUC18- F/pUC18-R. Sản phẩm PCR chọn dòng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.
(iii) Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen có sự tham gia của 3 loại hóa chất như sau:
Sol I (50 mM glucose; 25mM Tris HCl pH 8; 10mM EDTA pH8) Sol II (0,2M NaOH; SDS 1%)
Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O) Quy trình tách plasmid được thực hiện theo các bước:
(1) Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút, thu cặn.
(2) Hòa cặn trong 100µl Sol I đảo đều cho tan cặn. (3) Bổ sung 200 µl Sol II, đảo nhẹ trên đá trong 10 phút. (4) Bổ sung 150µl Sol III đảo nhẹ trên đá trong 10 phút.
(5) Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
(6) Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu dịch nổi. (7) Bổ sung Isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1. Ủ ở - 20o
C, trong 30 phút. (8) Ly tâm 13000 vòng/phút/ 4o
C, trong 10 phút, sau đó thu tủa.
(9) Bổ sung 500µl cồn lạnh 70% lắc nhẹ, ly tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, sau đó thu tủa.
(10) Làm khô mẫu trong hộp, bổ sung nước 40 µl RNAase, ủ 37o
C trong 30 phút.
(11) Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.