Dựa trên trình tự gen CHI của đậu tương đã công bố tại Ngân hàng Gen mang mã số NM_001248290 [23], cặp mồi đặc hiệu GmCHI-NcoI-F/ GmCHI- NotI-R có trình tự nucleotide được thiết kế cho phản ứng PCR để nhân bản gen GmCHI từ 3 giống đậu tương ĐT51, DT90, DT84 đã được trình bày ở bảng 2.3.
Cặp mồi được thiết kế bao gồm cả trình tự chứa điểm cắt của enzyme giới hạn để phục vụ cho việc thiết kế và kiểm tra vector chuyển gen sau này . Ở vị trí trước bộ ba mở đầu có bổ sung 9 nucleotide trên mồi xuôi GmCHI-NcoI-F chứa điểm cắt của enzyme NcoI và 11 nucleotide trên mồi ngược GmCHI-NcoI-R chứa
điểm cắt của enzyme NotI ngay sau bộ ba kết thúc . Đặc điểm của cặp mồi
GmCHI-NcoI-F/GmCHI-NotI-R đã thiết kế nhân gen GmCHI từ cây đâ ̣u tương cụ thể là:
GmCHI-NcoI-F: 5’ atgccatggATGGCAACGATCACCGCGGTT GmCHI- NotI-R : 5’ ttgcccggcgcACTATAATGCCGTGGCTC
Trình tự gen GmCHI đã được công bố bởi Ralston và cs (2015) mang mã số NM _001248290 trên GenBank có kích thước 657 nucleotide, mã hóa 218 amino acid [23].
Như vậy , đoa ̣n gen GmCHI đươ ̣c khuếch đa ̣i từ cDNA bằng cặp mồi GmCHI-NcoI-F/ GmCHI-NotI-R sẽ cho kết quả sản phẩm PCR dự kiến có kích thước là 9 + 657 + 11 = 677 nucleotide.
Hai giống đậu tương ĐT 51 và DT 84 khác biệt nhau về hàm lượng daidzein và genistein được sử du ̣ng làm đối tượng phân lâ ̣p gen GmCHI, phân
tích so sánh đặc điểm của gen GmCHI. Hạt của hai giống đậu tương ĐT 51, DT84 được ngâm ủ, nảy mầm, khi đươ ̣c 3 ngày tuổi tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng của thân rễ để phục vụ thí nghiệm tách chiết RNA. RNA tổng số được tách chiết và tổng hợp cDNA, gen GmCHI được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/ GmCHI-NotI-R và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen
GmCHI từ hai giống đậu tương (ĐT51 và DT84). Trong đó M: thang DNA 1,0
kb; giếng 1-ĐT51; giếng 2- DT84.
Kết quả nhân bản gen GmCHI ở hình 3.4 cho thấy băng DNA được khuếch đa ̣i có kích thước khoảng 0,65 kb, đúng như tính toán lý thuyết là kích thước của gen GmCHI. Như vậy, bước đầu gen GmCHI đã được nhân bản thành công từ mRNA của hai giống đâ ̣u tương ĐT51 và DT84.
3.2.2. Tách dòng cDNA của gen GmCHI trong tế bào khả biến E.coli
Băng DNA có kích thước khoảng 0,67 kb được tách khỏi bản gel , tinh sạch và gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
DH5 và chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp dựa vào kiểu hình khuẩn lạc . Những dòng khuẩn la ̣c màu trắng trong được lựa cho ̣n và kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn la ̣c với că ̣p mồi pUC 18-F/pUC18-R, dự kiến đoa ̣n DNA đươ ̣c nhân bản có kích thước 837 bp. Lựa cho ̣n ngẫu nhiên 4 dòng khuẩn la ̣c có kiểu hình trắng trong để tiến hành phản ứng col ony-PCR. Kết quả
chọn dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony -PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R đươ ̣c trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR vớ i că ̣p mồi pUC18- F/pUC18-R từ 4 dòng khuẩn lạc lựa chọn ngẫu nhiên; trong đó M: thang DNA
1 kb; giếng 1, 2: ĐT51; giếng 3,4: DT84.
Hình 3.5 cho thấy xuất hiện băng DNA có kích thước khoảng 0,85 kb từ 4 dòng khuẩn lạc, đúng như kích thước nhân bản đoa ̣n DNA bằng că ̣p mồi pUC18- F/pUC18-R. Plasmid tái tổ hợp đã được tách chiết từ 4 dòng khuẩn lạc dương tính với colony -PCR và được cắt kiểm tra bằng că ̣p enzyme giới ha ̣n NcoI và
2,7 kb
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pBT-GmCHI bằng că ̣p enzyme
NcoI và NotI; trong đó M: thang DNA 1 kb; giếng 1: pBT-GmCHI đã cắt;
giếng 2: pBT-GmCHI chưa cắt.
Theo lý thuyết vector pBT có kích thước 2705 bp, gen GmCHI có kích
thước 677 bp và tổng số nucleotide của vector tái tổ hợp pBT-GmCHI là 3382 bp. Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, ở giếng 2 vector pBT-GmCHI chưa cắt thu đươ ̣c
băng điê ̣n di DNA có kích thước khoảng hơn 3,0 kb, ở giếng 1 có 2 băng điê ̣n di DNA có kích thước khoảng 2,7 kb và 0,6 kb. Băng DNA có kích thước khoả ng 2,7 kb là kích thước của vector tách dòng pBT , còn băng DNA có kích thước khoảng 0,6 kb là kích thước của gen GmCHI. Như vậy, kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pBT -GmCHI bởi cặp enzyme giới ha ̣n NcoI và
NotI đú ng như tính toán lý thuyết . Do đó có thể kết luâ ̣n rằng , gen GmCHI đã đươ ̣c nhân dòng thành công trong vector pBT ở E.coli và plasmid tái tổ hợp