4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.1. Vật liệu nghiên cứu và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng giống đậu tương chịu hạn DT2008 trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp làm vật liệu nghiên cứu. Hạt của giống đậu tương DT2008 thu tại vụ Hè-Thu năm 2017 thể hiện ở hình 2.1.
Hình 2.1. Hạt của giống đậu tương DT2008
Giống đậu tương DT2008 được chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến chiếu xạ tia gamma trên hạt khô dòng 2001HC từ tổ hợp lai DT2001 với HC100. Theo các kết quả đã được khảo nghiệm công bố, giống DT2008 sinh trưởng hữu hạn, dạng cây bán đứng, lá hình trứng nhọn, hạt màu vàng và rốn hạt màu đen, thuộc nhóm giống trung ngày từ 95 – 110 ngày. Đặc biệt, DT2008 sinh trưởng khỏe, chiều cao cây từ 55 – 75cm, số cành cấp 1 trên cây lớn từ 3,5 – 4,5 cành, có khả năng chống chịu tổng hợp với những yếu tố bất lợi của sản
xuất như hạn úng, nhiệt độ, các loại bệnh, đất nghèo dinh dưỡng, cho năng suất cao.
Vector và chủng vi khuẩn
Vector tách dòng pBT và chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ ADN ứng dụng, viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Hình 2.2. Vector pBT sử dụng trong tách dòng phân tử gen GmDREB6 từ cây đậu tương
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam; phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Quá trình thực hiện phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.3.
RNA tổng số
cDNA
Trình tự nucleotide của gen GmDREB6
Giải trình tự nucleotide
Gen GmDREB6 của đậu tương
Cặpmồi DREB6- F/DREB6-R
GENBANK
Thiết kế
PCR
Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình thực hiện phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008
Hình 2.3 mô tả các bước tiến hành phân lập gen GmDREB6 từ cây đậu tương, bao gồm các bước: (1) Phân tích thông tin về gen DREB6 của đậu tương trên GenBank và thiết kế cặp mồi cho PCR nhân bản gen GmDREB6; (2) Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA bằng phiên mã ngược; (3) Khuếch đại gen GmDREB6 từ cDNA; (4) Tách dòng cDNA: tạo vector tái tổ hợp, nhân bản DNA tái tổ hợp trong E.coli DH5α, chọn dòng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp và tách plasmid tái tổ hợp; (5) Giải trình tự gen GmDREB6; (6) Xác định
gen GmDREB6 bằng BLAST trong NCBI.
2.2.1. Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen
Nghiên cứu thông tin và thiết kế cặp mồi với mục đích nhân bản gen
GmDREB6 được thực hiện qua các bước: (i) Phân tích và lựa chọn trình tự nucleotide của gen DREB6 của đậu tương từ GenBank; (ii) Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR; (iii) Tổng hợp mồi; (iv) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng PCR.
Chúng tôi thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R để nhân gen GmDREB6
dựa trên trình tự gen GmDREB6 đã công bố trên GenBank có mã số EF551166.1 [20]. Trình tự nucleotide của cặp mồi được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi
Cặp mồi Trình tự nucleotide 5’ 3’
Dự kiến kích thước của đoạn DNA được nhân bản
DREB6-F ATGGTCATGGAAGAATCTAAC 693 bp DREB6-R TTAATATGATTCCCATAGA
2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hạt đậu tương DT2008 được gieo trồng và tiến hành thu lá non để làm nguyên liệu tách chiết RNA tổng số. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số bằng bộ KIT Trizol Reagents của hãng Invitrogen được thực hiện như sau:
(1) Thu mẫu: cắt khoảng 1cm2 lá non cây đậu tương, cắt nhỏ rồi nghiền trong nito lỏng thành dạng bột. Hòa trong 1ml trizol sau đó đem sử dụng.
(2) Thí nghiệm tách RNA tổng số được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các bước tiến hành tách RNA tổng số
Bước Cách tiến hành
1 Lấy mẫu đã hòa trong trizol để 10 phút ở nhiệt độ phòng
2 Thêm 300 µl chloroform, đảo 15 giây để 3 phút trong nhiệt độ phòng 3 Ly tâm 8000 vòng/phút, 15p, 4
oC, chuyển pha trên vào ependoft mới
4 Thêm 500 µl isopropanol, đảo đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút. 5 Ly tâm 8000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC
6 Loại dịch nổi ngay sau khi ly tâm kết thúc 7 Rửa bằng 1ml ethanol 70% lạnh, đảo nhẹ. 8 Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. 9 Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC 10 Hòa tan trong 50 µl H2O
2.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số bằng bộ KIT SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis. Thành phần phản ứng tạo cDNA được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo cDNA
STT Thành phần Thể tích
1 5X VILO™ Reaction Mix 4 µl
2 10X SuperScript™ Enzyme Mix 2 µl
3 RNA (tối đa 2,5 μg) 2 µl
4 H2O Đến 20 µl
- Đảo đều rồi ủ 25oC 10 phút - Ủ 42oC 60 phút
- Kết thúc phản ứng ở 80oC 5 phút Sản phẩm cDNA được lưu giữ ở -20oC.
2.2.4. Phương pháp PCR
Gen GmDREB6 được phân lập từ cDNA tiến hành bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặt hiệu DREB6F/ DREB6R, sử dụng Master Mix của Promega. Thành phần phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 PCR Master Mix 2X 12,5 2 DREB6-F 10 pmol/μl 1,0 3 DREB6-R 10 pmol/μl 1,0 4 cDNA khuôn 25 ng/μl 2,0 5 Nước khử ion - 8,5 Tổng thể tích 25
Phản ứng được thực hiện trên máy PCR của hãng Eppendoft với chu trình nhiệt được thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Bảng chu kỳ nhiệt phản ứng nhân gen GmDREB6
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
30 3 Tiếp hợp mồi 55 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
6 Kết thúc và bảo quản 4 1
2.2.5. Tách dòng gen GmDREB6
Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và Russell (2001) [23] với các bước cơ bản sau đây:
(1) Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất.
(2) Sản phẩm PCR tinh sạch được gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm với thành phần và điều kiện phản ứng mô tả ở bảng 2.6. (3) Biến nạp vector tách dòng tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Duy trì hỗn hợp gồm 5µl vector tái tổ hợp và 50 µl dịch tế bào khả biến trong nước đá 20 phút, và chuyển ngay vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút 30 giây, sau đó đưa ngay vào nước đá trong thời gian 10 phút. Sau khi sốc nhiệt bổ sung 150 – 300 µl LB lỏng để nuôi phục hồi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ. Cấy trải 150 – 250 µl dịch khuẩn lên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 50mg/l, X-gal 30mg/l và IPTG 100 µM rồi nuôi ở 37oC trong vòng 16 giờ.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB6 vào vector tách dòng
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0
2 T4 DNA Ligase 5u/μl 1,0
3 GmDREB6 100ng/μl 12,0
4 pBT 100ng/μl 3,0
5 Nước khử ion - 2,0
Tổng 20
Điều kiện phản ứng: 22oC trong 3 giờ
(4) Sàng lọc các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR: Dùng tăm tre khử trùng chấm những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp gen GmDREB6, hoà ngay vào 10µl nước khử ion - dung dịch này dùng làm DNA khuôn cho phản ứng colony-PCR.
Bảng 2.7. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.coli
Môi trường Thành phần
LB lỏng Pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Cao nấm men 5g/l, pH = 7 LB đặc LB lỏng + agar 16g/l
(5) Tách chiết plasmid bằng KIT Plasmid Extraction theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
(6) PCR kiểm tra plasmid bằng cặp mồi đặc hiệu.
2.2.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý kết quả
Trình tự nucleotide của gen GmDREB6 được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.
Phân tích trình tự nucleotide của gen GmDREB6 bằng phần mềm BLAST trong NCBI, BioEdit 5.0.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 DT2008
3.1.1. Thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R
Bằng công cụ Tin sinh học, dựa trên bản đồ gen đậu tương đã xác định được gen GmDREB6 có vị trí trên NST số 5 (LOC100101914) [26]. Khảo sát đoạn mã hóa của gen GmDREB6 trên GenBank đã xác định được hai trình tự gen mang mã số EF551166 [20] và NM_001248412.2 [27]. Trình tự gen mang mã số EF551166 và NM_001248412.2 chứa đoạn mã hóa có 693 bp, mã hóa 230 amino acid. Chúng tôi chọn trình tự mang mã số EF551166 cho thiết kế cặp mồi PCR nhân bản đoạn mã hóa của gen GmDREB6, kết quả thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R
Từ kết quả của hình 3.1 cặp mồi PCR nhân bản gen GmDREB6 được
ATGGTCATGGAAGAATCTAAC AGATACCCTTAGTATAATT - -
DREB6-F: 5’– ATGGTCATGGAAGAATCTAAC - 3’
DREB6-R: 5’- TTAATATGATTCCCATAGA -3’
Đoạn DNA được nhân bản dự kiến có kích thước là 693 bp. Kết quả kiểm tra trình tự nucleotide của cặp mồi DREB6-F/DREB6-R được thực hiện bằng phần mềm BioEdit.
3.1.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
Mẫu lá non thu từ giống đậu tương giống DT2008 được sử dụng để tách chiết RNA tổng số bằng KIT Trizol Reagents. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ lá non của giống đậu tương DT2008.
Giếng 1, 2: RNA tổng số
RNA tổng số của đậu tương DT2008 sau khi xử lý bằng DNase được sử dụng để tổng hợp cDNA. Sử dụng KIT SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis, bằng phản ứng phiên mã ngược từ RNA tổng số tạo được cDNA làm nguyên liệu cho PCR nhân bản gen GmDREB6.
3.1.3. Kết quả nhân bản gen GmDREB6
Từ cDNA, bằng PCR với cặp mồi DREB6-F/DREB6-R đoạn mã hóa của gen GmDREB6 đã được khuếch đại. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen
GmDREB6 được thể hiện trên hình 3.3.
0,75 kb
0,5 kb
0,69 kb
M 1 2 3
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6
(cDNA) từ mRNA của giống đậu tương DT2008. M: Thang DNA 1 kb; 1, 2, 3: gen GmDREB6
Kết quả nhân gen trên hình 3.3 cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại đoạn mã hóa của gen GmDREB6 thu được băng đặc hiệu với kích thước khoảng 0,69 kb, đúng như tính toán theo lý thuyết. Như vậy, bước đầu đã xác nhận rằng, gen
GmDREB6 được khuếch đại thành công từ RNA tổng số của giống đậu tương DT2008. Sản phẩm PCR thu được được tinh sạch trực tiếp và sử dụng để tách dòng gen.
3.2. Tách dòng và giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008
3.2.1. Kết quả tách dòng gen DREB6
Sản phẩm PCR đoạn gen GmDREB6 đã tinh sạch được sử dụng cho phản ứng gắn nối vào vector pBT (kích thước 2705 bp) để tạo vector tái tổ hợp pBT– GmDREB6. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α, các khuẩn lạc mang vector được chọn lọc trên môi trường kháng sinh Ampicillin, có chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal.
Theo lí thuyết, tế bào chứa plasmid sẽ phát triển được trên môi trường có chứa kháng sinh Ampicillin. Các tế bào mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn chèn xen vào giữa gen LacZ sẽ không tạo ra protein LacZ để chuyển hóa cơ chất Xgal, các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc trắng. Trái lại, các tế bào mang plasmid tự đóng vòng, có khả năng chuyển hóa cơ chất X-gal, với sự có mặt của chất cảm ứng IPTG sẽ phát triển thành khuẩn lạc xanh.
Năm dòng khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiến hành phản ứng colony- PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmDREB6 trong E.coli. Kết quả điện di kiểm tra phản ứng colony-PCR được thể hiện trên hình 3.4.
0,75 kb 0,5 kb
0,69 kb
M 1 2 3 4 5
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân bản gen
GmDREB6 từ 5 dòng khuẩn lạc màu trắng. M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1, 3, 4, 5: sản phẩm colony-PCR; Giếng 2: không có sản phẩm colony-PCR
Theo kết quả thể hiện trên hình 3.4, các khuẩn lạc 1, 3, 4, 5 cho kết quả dương tính với phản ứng colony-PCR, sản phẩm PCR thu được một băng có kích thước như dự kiến là khoảng 0,69 kb. Khuẩn lạc số 2 không xuất hiện cho kết quả âm tính với phản ứng colony-PCR. Các dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính với phản ứng colony-PCR được nuôi tăng sinh và sử dụng để tách chiết plasmid phục vụ giải trình tự nucleotide.
3.2.2. Kết quả giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008
Kết quả giải trình tự đoạn DNA từ plasmid tái tổ hợp pBT-GmDREB6
trên thiết bị tự động thu được trình tự nucleotide có kích thước 693 bp. Để khẳng định đoạn DNA đã đọc trình tự nucleotide là đoạn mã hóa của gen
GmDREB6 chúng tôi tiến hành phân tích trực tuyến bằng phần mềm BLAST trong NCBI, kết quả thu được ở hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008
Hình 3.5 cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có độ tương đồng 100% so với hai trình tự gen mang mã số NM_001248412.2 và EF551166. Kết quả phân tích BLAST cho phép khẳng định đoạn gen phân lập từ giống đậu tương DT2008 là gen Glycine max
đậu tương. Trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB6 có kích thước 693 bp mã hóa 230 amino acid (Hình 3.6).
Hình 3.6. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen
3.3. Đặc điểm của trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008
3.3.1. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với trình tự EF551166 và NM_001248412.2 trên GenBank tương DT2008 với trình tự EF551166 và NM_001248412.2 trên GenBank
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với gen GmDREB6 mang mã số trên GenBank là EF551166 và NM_001248412.2, kết quả được thể hiện trên hình 3.7 và bảng 3.1.
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166,
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự mang mã số EF551166,
NM_001248412.2 TT Vị trí nucleotide DT2008 EF551166 NM_001248412.2 1 19 T A A 2 20 T A A 3 51 A T T 4 52 A T T 5 75 A T T 6 197 T A A 7 319 C G G 8 320 C G G 9 408 C G G 10 409 C G G 11 580 A T T 12 581 A T T 13 635 G C C 14 636 G C C 15 680 C G G 16 681 C G G
Bảng 3.1 và hình 3.7 cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6
phân lập từ giống đậu tương DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với
trình tự nucleotide của gen GmDREB6 mang mã số EF551166 và
NM_001248412 trên GenBank, đó là các vị trí 19, 20, 51, 52, 75, 197, 319, 320, 408, 409, 580, 581, 635, 636, 680, 681. Tất cả những sai khác này đều là sự thay thế cặp A-T bằng G-C hoặc G-C bằng A-T. Vấn đề đặt ra là sự thay thế
cặp nucleotide có làm thay đổi amino acid hay không cần phải tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6.
3.3.2. So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 của giống DT2008 với trinh tự amino acid suy diễn của EF551166 và NM_001248412