Ý tưởng nghiên cứu của đề tài

Hóa trị liệu là một trong ba phương pháp phổ biến nhất hiện nay để điều trị ung thư có hiệu quả nhất. Đây là liệu pháp sử dụng thuốc hay dược phẩm để tiêu diệt, ngăn chặn hay làm chậm sự phát triển của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, các loại thuốc điều trị ung thư thường không mang lại hiệu quả mong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích chưa cao và hiệu quả thâm nhập khối u kém vì khả năng hòa tan của thuốc thấp. Do đó, khả năng điều trị bệnh rất hạn chế. Để giải quyết vấn đề này, một trong những bước đột phá là sử dụng công nghệ nano để tạo dạng vật liệu có kích thước nano có khả năng tan trong nước, khuyếch tán tốt nên tương tác hiệu quả với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở mức phân tử.

Các nghiên cứu đã công bố khẳng định AMG là chất kháng ung thư tiềm năng thông qua việc ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư và cảm ứng apoptosis ở các tế bào này [11,26]. Tuy nhiên, cũng giống như curcumin và

paclitaxel, khả năng hòa tan chất này trong nước rất thấp (chỉ đạt 0,0002%), vì thế đã hạn chế lớn hoạt tính sinh học và ứng dụng của nó. Cho đến nay, ngoài việc nghiên cứu tổng hợp những dẫn suất mới của nó để tăng cường tính tan và hiệu quả tác dụng thì cũng đã bắt đầu xuất hiện một số nghiên cứu trên thế giới về việc nâng cao tính tan của AMG sử dụng phương pháp tạo hạt nano để xử lý các bệnh liên quan đến ung thư. Vì thế, nghiên cứu của chúng tôi sẽ nhằm mục đích sử dụng công nghệ nano để tạo hạt nanoAMG (nanomangostin) có khả năng phân tán tốt trong nước nhưng vẫn duy trì được hoạt tính sinh học của nó.

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi

Dòng tế bào ung thư phổi A549 được mua từ bộ sưu tấp giống của Hoa Kỳ (American Type Culture Collection- ATCC Manassas, Hoa Kỳ). Tế bào ung thư phổi A549 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung L-

glutamine 2 mM, HEPES 10 mM, natri pyruvate 1.0 mM và huyết thanh phôi bò 10% (FBS; Gibco, Hoa Kỳ) trong tủ ấm ở 37oC chứa CO2 5%

2.2. Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu mua từ tỉnh Bình Dương và được Viện sinh thái và Tài nguyên vi sinh vật giúp định tên khoa học là Garcinia mangostana

L. Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60oC, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích dung môi. Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo.

2.3. Hóa chất, thiết bị. 2.3.1. Hóa chất 2.3.1. Hóa chất

-Bản silica gel tráng sẵn (Silicagel 60 F254) được mua từ hãng Mecrk (Đức).

-Hạt Silica gel cho chạy cột sắc ký (Grade 7734, 63-200 μm, 70- 230 mesh) được mua từ hãng Mecrk (Đức).

-Alpha, Beta và Hydroxy - β cyclodextrin được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ). Eudragit RS 100 và RL 100 mua từ hãng Evonik (Singapore)

-Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc.

-Môi trường nuôi cấy tế bào (Invitrogen, Hoa Kỳ) -Tất cả các hoá chất đều đạt độ tinh khiết cho phân tích.

2.3.2. Thiết bị

- Cân phân tích

- Ống thủy tinh sắc ký - Phễu chiết

- Máy đo quang phổ - Máy đo pH

- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng - Box cấy laminare

- Máy quay cất khô chân không - Máy khuấy từ

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao - Kính hiển vi đồng tụ quét laser

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt

2.4.1.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn có độ dày 1mm (Silicagel 60 F254, Merck). Các hệ dung môi phân tích được sử dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2: 1; ii) n- Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) n-Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ 3:1. Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng. Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi NH3.

2.4.1.2. Sắc ký cột silica gel

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Đối với sắc ký cột:

- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, được nạp nén vào trong một cột có kích thước xác định được tính toán dựa trên lượng mẫu sẽ nạp lên cột.

- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rửa giải.

Trong thí nghiệm này, phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi hạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hệ

dung môi đã lựa chọn với các bước gradient khác nhau. Các phân đoạn tinh sạch sau đó được kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).

2.4.1.3. Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ). Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung carbon. Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu.

2.4.2. Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh giá các đặc trưng của hạt giá các đặc trưng của hạt

2.4.2.1. Phương pháp tổng hợp vật liệu hạt nanomangostin

Phương pháp khuyếch tán dung dịch sẽ được sử dụng để tổng hợp hạt nanomangostin. Các vật liệu polymer mang như α, β, hdroxy- β cyclodextrin, Eudragit RS/RL 100, sẽ được thử nghiệm để tạo hạt nanomangostin. Đây là những chất mang có cấu trúc đơn giản, tan tốt trong nước vàan toàn sinh học, chưa được sử dụng trong các nghiên cứu tạo hạt nanomangostin trước đây [13]

2.4.2.2. Xác định thế zeta của hạt

Hạt nanomangostin được xác định điện tích bề mặt và đo độ phân bố hạt sử dụng máy Dynamic Light Scattering system (DLS, Zetasizer Ver.6.20, Malvern Instruments – UK).

2.4.2.3. Xác định kích thước hạt

Hình thái và kích thước hạt nanomangostin được xác định sử dụng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (Field Emission Scanning Electron Microscope )(FE-SEM, Hitachi-S4800, Japan) và kính hiển vi đồng tụ quét laser (Olimpus, Japan).

2.4.2.4. Xác định hàm lượng AMG

Hàm lượng AMG trong sản phẩm cuối cùng được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng A243 nm và trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hitachi, detector DAD L2455, Japan). AMG (Sigma-Aldrich) được sử dụng làm chất chuẩn. AMG chuẩn được hòa tan trong methanol ở nồng độ 1 mg/ml làm dung dịch chuẩn gốc. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiếp tục pha loãng trong methanol để được dãy chuẩn làm việc. Mẫu hạt NMG cũng được chuẩn bị theo cách tương tự. Các dung dịch được trộn đều và lọc qua màng lọc có kích thước 0.45m. Hàm lượng AMG được đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC theo các điều kiện sắc ký như sau: Cột Kromosilk -C18 RP (4.6 x 250 mm, 5µm); Tốc độ dòng chảy (pha động): methanol (kênh A) vànước (kênh B) = 95:5; Tốc độ dòng chảy: 1ml/min, detector (DAD): 319 nm; nhiệt độ cột: 30oC.

2.5. Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549

Hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư được đánh giá sử dụng phương pháp MTT. Cụ thể là, tế bào ung thư A 549 (105 tế bào/ml) được xử lý 24 giờ với chất nghiên cứu ở các nồng độ khác (0; 2,5; 5,0; 10; 20,0 μg/ml) được hòa tan trong DMSO đối với AMG hoặc nước đối với NMG. Sau khi ủ, dung dịch MTT 0,1 μg/ml được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37°C trong 4 giờ. Môi trường nuôi tế bào sau đó được loại bỏ và DMSO (150 μL) được thêm vào để hòa tan kết tủa formazan. Hoạt tính ức chế 50% phát

triển (IC50) sau đó được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng A540 nm.

2.6. Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào

Dựa trên việc AMG có khả năng phát huỳnh quang, được kích thích ở bước sóng 445 nm và phát quang ở bước sóng 480 nm, chúng tôi đã khai thác tính chất này để đánh giá khả năng thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư. Tế bào A549 được xử lý với AMG không nano hóa (dạng tự do) và hạt NMG ở nồng độ thích hợp. Mẫu thí nghiệm sau 6 giờ xử lý sẽ được rửa sạch với PBS và cố định với paraformaldehyde 4% trong 30 phút. Sau đó, tế bào sẽ được soi trực tiếp dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser (IX71 inverted fluorescent microscope, Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) ở độ phóng đại 96X.

2.7. Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào

Nhân tế bào ung thư phổi A549 sau khi xử lý với NMG và AMG tự do ở nồng độ IC50 sẽ được ủ với Hoechst 33342 ở nồng độ 1.6 uM. Sau khi ủ 30 phút, các tế bào được rửa với PBS và được quan sát dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser (IX71 inverted fluorescent microscope, Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan).

2.8. Xử lý thống kê

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t- test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu quy trình tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt

3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa AMG từ vỏ quả măng cụt

Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện thấy cây măng cụt, đặc biệt là vỏ quả và vỏ cây, chứa nhiều hợp chất phenol nhất là nhóm chất xanthone trong

đó có AMG [10]. Đến nay, đã có hơn 60 dẫn xuất xanthone khác nhau trong măng cụt được tinh sạch và xác định cấu trúc (Dictionary of Natural Products - DNP on CD-Rom). Mặc dù đã trở thành chế phẩm hóa chất thương mại trong thời gian gần đây, nhưng giá thành của chất này còn rất cao (150 USD/10 mg- Sigma). Trong khi đó, việc nghiên cứu sâu cũng như ứng dụng đòi hỏi cần một lượng chất lớn. Vì thế, việc tách và tinh sạch chúng từ nguồn nguyên liệu tự nhiên là cần thiết.

Để tinh sạch các xanthone, phần lớn các phòng thí nghiệm đều bắt đầu bằng việc sử dụng dịch chiết với ethanol hay methanol. Các xanthone sẽ được tinh sạch từ các dịch chiết này bằng phương pháp sắc ký trên các cột silica gel sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có tỉ lệ phân cực khác nhau để đẩy dần các chất này ra khỏi cột. Nhìn chung, để tinh sạch được một chất xanthone phải sử dụng thêm nhiều phương pháp sắc ký khác như sắc ký ngược pha, sắc ký trên cột sephadex LH-20, nên rất phức tạp và tốn kém. Nguyễn Thị Mai Phương (2005)[4] cũng đã tách được AMG từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:1:1. Tuy vậy, qui trình tách chiết chất này tỏ ra không hiệu quả mặc dù khá đơn giản vì hiệu suất thu hồi sản phẩm rất thấp. Các tác giả này cũng phát hiện thấy rằng các chất phenol có hoạt tính sinh học quan tâm là những chất có hệ số Rf lớn, nằm trong khoảng từ 0,8 đến 0,9 đồng nghĩa với việc chúng có tính phân cực thấp. Nhóm nghiên cứu này sau đó đã đơn giản hóa quá trình tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt bằng cách sử dụng những phân đoạn chiết trong dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như toluene, chloroform hay n-hexane nhằm loại bỏ phần lớn các chất không mong muốn khác có trong nguyên liệu ban đầu. Dung môi n-hexane đã được lựa chọn vì nó có điểm sôi thấp hơn (61oC) so với chloroform hay toluene (>100 oC) và cũng có hằng số lưỡng điện (dielectric constant) rất thấp (1,89 so với 4,81 của chloroform và 2,38 của toluene). Nhờ vậy, qui trình tinh sạch này

đã có hiệu suất cao hơn. Nhóm tác giả đã tinh sạch AMG sử dụng quy trình gồm các bước: i)tách chiết phân đoạn trong n-hexane; ii) sắc ký phân đoạn cao chiết n-hexane trên 2 cột silica gel liên tiếp sử dụng hệ dung môi rửa chiết n- hexane: ethyl acetate: methanol với gradient dung môi có tính phân cực tăng dần. Bằng quy trình này, AMG đã được tinh sạch hoàn toàn với hiệu suất thu hồi đạt 0,013% và độ sạch đạt > 96% [5]. Hiệu suất này cao hơn nhiều so với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng đã thực hiện trước đây [4]. Tuy nhiên, có thể thấy quy trình được đưa ra vẫn chưa đạt hiệu quả cao so với các quy trình đã được các tác giả khác công bố.

Với mục đích tìm ra được quy trình tinh sạch AMG tối ưu hơn, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch AMG từ phân đoạn chiết n- hexane sử dụng cột sắc ký silica gel với hệ dụng môi rửa chiết được thay đổi. Cụ thể như sau:

Bột nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô (2,0 kg) đã tiến hành chiết rút với ethanol bằng phương pháp ngâm chiết theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích ethanol trong 3 ngày để thu cao ethanol tổng số. Ethanol đã được khẳng định là dung môi phù hợp nhất để chiết rút polyphenol từ vỏ quả măng cụt xét về tiêu chí hiệu suất thu hồi cao chiết và hiệu quả kinh tế của quy trình thu nhận. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần. Dịch chiết sau đó được cô cất quay để thu cao ethanol tổng số. Khối lượng cao ethanol tổng số thu được từ thí nghiệm này là 153,6 g.

Để thu nhận phân đoạn chiết n-hexane, cao ethanol tổng số được hòa vào nước và tiến hành chiết phân đoạn với n-hexane trong phễu chiết. Phần phân đoạn n-hexane sau khi thu được quay cất khô chân không và cân để định lượng phân đoạn thu được. Trong thí nghiệm này, lượng cao phân đoạn n-hexane thu được là 8,2 g chiếm 0,41% so với khối lượng ban đầu.

Độ sạch của phân đoạn n-hexane được kiểm tra bằng phương pháp TLC trên bản silica gel (Hình 3.1) sử dụng hệ dung môi n-hexane : acetone theo tỉ lệ

3:1 với chất chuẩn AMG (Sigma) làm đối chứng. Kết quả thu được cho thấy phân đoạn n-hexane có chứa AMG và có độ sạch tăng lên rõ rệt so với dịch chiết tổng số trong ethanol (Hình 3.1).

1 2 3

Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n- hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi hexane: acetone (3:1). 1. Chất chuẩn; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân đoạn chiết n-hexane.

3.1.2. Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt

3.1.2.1. Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để chạy cột sắc ký silica gel

Để tinh sạch thành công chất nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký thì việc chọn lựa được hệ dung môi sắc ký thích hợp là hết sức quan trọng. Dựa trên kinh nghiệm và tham khảo các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phân tách phân đoạn n-hexane trên TLC sử dụng 3 hệ dung môi là n- hexane: ethyl acetate (2:1); n-hexane: ethyl acetate (3:1) và n-hexane: acetone (3:1). Kết quả thu được cho thấy hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1) là phù hợp nhất để tinh sạch AMG từ phân đoạn n-hexane.

1 2 3 A 1 2 3 B 1 2 3 C

Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi: A)n- hexane: ethyl acetate (2:1); B)n- hexane: ethyl acetate (3:1); C) n-hexane: acetone (3:1). 1. Chất chuẩn; 2. Phân đoạn chiết ethanol;