3.2.2.1. Lựa chọn chất mang AMG
Chất mang cyclodextrin dạng α và β, hydroxy ß-cyclodextrin và eudragit RS100 /RL100 đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Dạng hydroxyl và α - cyclodextrin có độ tan trong nước cao hơn dạng beta. Vì thế, chúng tôi cho rằng chất mang hydroxyl và α-cyclodextrin sẽ ưu việt hơn beta khi tổng hợp hạt. Các nghiên cứu mới công bố của Pignatello và cộng sự [21] cho thấy Eudragit RS100 /RL100 cũng là chất mang khá tốt. Tuy nhiên, kết quả thu được (Bảng 3.3) đã không như chúng tôi dự đoán. Dạng β - cyclodextrin cho hiệu quả tạo hạt tốt hơn hẳn dạng hydroxy ß-cyclodextrin và α - cyclodextrin thể hiện ở chỗ hệ hạt thu được có độ tan tốt hơn (không bị kết tủa sau 10 ngày chế tạo) và kích thước nhỏ hơn. Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn β- cyclodextrin cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Đánh giá hiệu quả mang AMG của các chất nghiên cứu
Chất mang Kích thước (nm) Hàm lượng AMG (mg/ml) Độ tan
(sau 10 ngày chế tạo)
α - cyclodextrin 120 0,3 Xuất hiện tủa
β - cyclodextrin 50 0,6 Không tủa
Hydroxy ß- cyclodextrin
150 0,4 Xuất hiện tủa
Eudragit RS100 /RL100
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ chất mang ß- cyclodextrin và AMG
Để đánh giá hiệu quả mang (tải trọng mang AMG) của ß-cyclodextrin, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp hạt NMG sử dụng các tỉ lệ chất mang và hoạt chất khác nhau là 1:1; 1:2.5 và 1:5. Kết quả được trình bày tại bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ trộn của chất mang β- cyclodextrin và AMG lên các thông số hạt
Tỉ lệ phối trộn chất mang và AMG Hàm lượng AMG (mg/ml) tại A243 1:1,0 0,45 1:2,5 2,54 1:5,0 1,01
Số liệu bảng 3.4 cho thấy công thức phối trộn 1: 2,5 cho kết quả tốt nhất, thể hiện ở chỗ hàm lượng AMG cao nhất, đạt 2,54 mg/ml so với 0,45 mg/ml (tỉ lệ 1:1,0) và 1,01 mg/ml (tỉ lệ 1:5,0). Vì thế, công thức này đã được lựa chọn để tổng hợp hạt nanoplymer bọc AMG cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.3. Xác định thông số hạt NMG sử dụng chất mang ß- cyclodextrin
Sử dụng công thức tạo hạt đã được thiết lập ở trên, dung dịch nano NMG thu được có màu vàng trong suốt (Hình 3.10)
Hình 3.10. Dung dịch NMG thu được sử dụng chất mang ß- cyclodextrin
Dung dịch AMG trong nước Dung dịch
Các thông số vật lý của hạt cũng đã được kiểm tra và cho các kết quả như sau:
Hình thái và kích thước hạt nanomangostin: Các thông số này được xác định sử dụng máy DLS và kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE- SEM. Kết quả đo trên máy DLS (Hình 3.10) cho thấy hạt NMG thu được có kích thước đạt 50 nm với mật độ > 60%.
Hình 3.11. Kích thước hạt NMG đo trên máy DLS
Kết quả chụp FE-SEM (Hình 3.12A) và kính hiển vi đồng tụ quét lasercũng cho thấy hạt NMG thu được có kích thước < 50 nm có khả năng tự phát quang màu xanh lục (green) tại bước sóng vùng 500-600 nm khi bị kích thích ở vùng ánh sáng 400 nm (Hình 3.12B). Như vậy các kết quả kích thước hạt NMG đo từ DLS là phù hợp với kết quả FE-SEM.
Hình 3.12A. Ảnh chụp FE-SEM hạt NMG
Hình 3.12B. Ảnh chụp kính hiển vi đồng tụ quét laser hạt NMG
Xác định thế zeta
Hạt NMG được xác định điện tích bề mặt và đo độ phân bố hạt sử dụng máy DLS. Theo lý thuyết thì các hạt có thế zeta > - 40 mV là bền. Trong nghiên cứu này, thế zeta của NMG đạt -38 mV, gợi ý hạt NMG thu được có độ bền tốt (Hình 3.13).
Hình 3.13. Thế zeta của hạt NMG đo trên máy DLS 3.3.
3.2.2.4. Hiệu quả bao gói của hạt NMG
Hàm lượng AMG trên hạt được xác định sử dụng hệ thống khối phổ LC- MS. Các kết quả thu được cho thấy NMG đã được tổng hợp thành công vì có một đỉnh xuất hiện với thời gian lưu (retention time) là 25.3 - 25.6 min cho cả NMG và AMG (số liệu không trình bày). Hàm lượng AMG trong dung dịch hạt nano đạt 2,90 0,25 mg/ml. Hiệu quả bao gói của hạt AMG cũng được xác định dựa trên tỉ lệ giữa hàm lượng AMG đo được của hạt NMG và hàm lượng NMG sử dụng để tổng hợp hạt. Kết quả cho thấy hiệu quả bao gói đạt 74,3%.
3.2.2.5 Tác dụng kháng tế bào ung thư phổi A549
Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã cho thấy AMG có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư, trong đó có dòng tế bào
ung thư phổi A549 [13]. Để tìm hiểu xem liệu tương tác của AMG với ß- cyclodextrin có làm ảnh hưởng đến hoạt tính của NMG hay không, hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi A549 của NMG đã được kiểm tra ở các nồng độ khác nhau 0; 2,5; 5,0; 10; 20,0 μg/ml. Các kết quả thu được ở hình 3.14 cho thấy NMG thể hiện hoạt tính gây độc mạnh lên các tế bào ung thư theo cách phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 đạt 4,86 µg/mL. Giá trị IC50 của AMG đạt 2,34 µg/ml. Dung dịch chất mang ß-cylodextrin cũng được kiểm tra độc tính trên dòng tế bào này. Kết quả cho thấy ß-cylodextrin không thể hiện hoạt tính gây độc (số liệu không trình bày).
Hình 3.14. Hoạt tính gây độc tế bào của NMG tan trong nước lên dòng tế bào ung thư A549. NMG () và AMG (). Các tế bào ung thư (105 tế bào/ml) được xử lý với các nồng độ chất khác nhau (NMG tan trong nước; AMG tan
trong DMSO).
Như vậy, NMG đã thể hiện hoạt tính kháng ung thư in vitro gần tương tự với AMG tự do tan trong DMSO. Điều đó chứng tỏ NMG đã phân tán tốt trong nước và thể hiện hoạt tính của chất AMG. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của hạt nano mang các chất tự nhiên cũng đã được công bố, trong đó có các chất tự nhiên như curcumin, parlitaxel… [6, 8, 22, 29]. Có thể thấy rằng việc tạo hạt nano bọc chất tự nhiên là hướng tiếp cận mới và khả thi để tăng sinh khả dụng và ứng dụng của chúng.
A5
4
9
3.2.2.6.Khả năng xâm nhập của NMG vào tế bào ung thư phổi
Kết quả quan sát sự phát quang của AMG và NMG trong tế bào ung thư đã xử lý với các chất này so với đối chứng tại bước sóng 485nm ở hình 3.15 đã cho thấy tế bào đối chứng không có khả năng phát quang trong khi tế bào được xử lý với AMG và NMG có khả năng này. Tế bào xử lý NMG có khả năng phát quang mạnh hơn tế bào xử lý AMG, gợi ý rằng NMG đã được xâm nhập tốt hơn vào tế bào. Điều đó cũng giải thích tại sao NMG có khả năng gây độc tế bào A549.
A B C
Hình 3.15. Khả năng xâm nhập của NMG vào tế bào ung thư phổi. (A). Đối chứng; (B). Xử lý AMG (2µg/ml); (C) xử lý NMG (2µg/ml).
3.2.2.7. Kích thước nhân tế bào khi xử lý với NMG
Quan sát hình thái nhân tế bào ung thư phổi dưới kính hiểm vi đồng tụ quét laser sau khi nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang Hoesch cho thấy ở mẫu xử lý chất AMG kích thước nhân không có nhiều khác biệt so với mẫu đối chứng. Trong khi đó, ở mẫu xử lý tế bào NMG thì tế bào nhân to hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Điều đó chứng tỏ NMG đã xâm nhập vào nhân tế bào và đã ảnh hưởng đến kích thước của nhân.
A B C
Hình 3.16. Hình thái nhân tế bào khi xử lý với AMG và NMG (A). Đối chứng; (B). Xử lý AMG; (C) xử lý NMG.
Trong số nhiều giải pháp khác nhau đối với các hệ thống dẫn truyền thuốc tới các vị trí bệnh, có hai giải pháp được quan tâm nhất là: i) tích thuốc tại các vị trí bệnh của hướng đích thụ động dựa vào tính thấm dễ dàng của các chất mang thuốc trong máu; ii) hướng đích chủ động dựa vào sự gắn các phối tử đặc biệt lên bề mặt chất mang để nhận ra và liên kết với các tế bào bệnh.
Nguyên tắc của việc nhả thuốc theo cơ chế thụ động là dựa trên việc môi trường xung quanh khối u có nhiều điểm khác biệt so với tế bào lành. Sự khác nhau về độ pH giữa tế bào ung thư và tế bào lành là: tế bào ung thư có độ pH thấp (2 - 3); có nhiệt độ cao (38 - 40oC) và trên bề mặt có rất nhiều loại vitamin (nhiều nhất là nhóm B9), trong khi đó các tế bào thường có pH và nhiệt độ tương ứng trong khoảng 7,2 - 7,4 và 36,5 - 37oC. Các tế bào của khối u có mức độ trao đổi chất cao nên sử dụng quá trình đường phân để nhận thêm năng lượng, hình thành các axit hữu cơ làm giảm pH của môi trường xung quanh tế bào u. Cấu trúc các hạt nano dẫn thuốc rất nhạy cảm với pH. Chúng ổn định ở pH sinh lý là 7,2 - 7,4 nhưng sẽ bị phân giải trong môi trường pH thấp hơn giá trị sinh lý này. Khi đó thuốc sẽ được giải phóng tại mô đích.
Một đặc điểm quan trọng nữa giúp tăng cường hiệu quả tác dụng đối với hệ dẫn truyền thụ động là kích cỡ của hạt nano và sự phân bố kích cỡ vì chúng
liên quan đến các đặc điểm của khối u. Môi trường khối u là một môi trường phức tạp, nơi bất bình thường về giải phẫu và sinh lý học. Sự phát triển của tế bào ung thư không được kiểm soát và sự tiết các yếu tố tạo mạch dẫn đến hệ mạch máu phát triển vô tổ chức và các môi trường ngoại mạch dày đặc. Những khiếm khuyết cấu trúc này là nguyên nhân của hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (Enhanced permeability DNA retention effect - EPR), là nguồn gốc của sự tích lũy và lưu trữ không đồng đều các vât liệu nano trong khối u. Sự mất cân bằng trong điều hòa tăng sinh mạch máu dẫn đến kết quả là các nhân tố sinh trưởng sẽ làm cho mạch máu khối u mất tổ chức và thủng rất nhiều lỗ, tạo khoảng cách giữa các tế bào nội mô và làm thoát mạch. Kích thước các lỗ mạch của các vi mạch máu khối u dao động từ 100 đến 500 nm [27]. Do đó, kích thước hạt nano đóng một vai trò quan trọng trong tích lũy khối u thông qua hiệu ứng EPR. Kích thước của hạt nano sử dụng trong một hệ thống phân phối thuốc cần đủ lớn để ngăn chặn sự rò rỉ nhanh chóng ở các mạch máu, nhưng phải đủ nhỏ để không bị hệ miễn dịch đào thải. Vì vậy, để tận dụng hiệu ứng EPR và thoát khỏi hàng rào miễn dịch, nhiều nghiên cứu đã đưa ra phạm vi kích thước hạt nano tối ưu khoảng 10-250 nm.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, hạt NMG đã được tổng hợp thành công và thể hiện được những ưu việt hơn so với các hạt nano đã công bố trước đây và so với dạng chất chưa nano hóa. Điều này được thể hiện ở các điểm sau:
Trước hết, tính tan trong nước là tiêu chí lý tưởng của một chất có thể dùng làm thuốc. Khả năng tan tốt trong nước của NMG rõ ràng là đặc điểm ưu việt của chất này so với dạng tự nhiên.
Về kích thước, hạt NMG tạo được có kích thước < 50 nm sử dụng hệ dẫn đơn giản những vẫn đảm bảo độ bền của hạt. Với kích thước hạt này, NMG có thể lọt được các lỗ mạch trong các khối u ung thư theo hướng vận chuyển thuốc thụ động, tận dụng hiệu ứng EPR và thoát khỏi hàng rào miễn dịch.
Các kết quả về hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư phổi A549 thu được của hạt NMG chứng tỏ tương tác của AMG với chất mang dường như đã không làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất này. Vì vậy, hoạt tính sinh học của chất tự nhiên vẫn được duy trì.
Tóm lại, hạt NMG sinh tổng hợp được đã chứng tỏ khả năng gây độc tế bào ung thư phổi mạnh và có triển vọng ứng dụng. Mặc dù vậy, các nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành để tối ưu công thức tạo hạt cũng như chứng minh đầy đủ cơ chế tác dụng của hạt tạo được, làm cơ sở để ứng dụng chứng trong điều trị bệnh.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã đưa ra được qui trình tinh sạchα-mangostin đơn giản từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) gồm 2 bước chính là: i) chiết phân đoạn với n-hexane và ii) sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : accetone theo tỉ lệ 3:1. Chất thu được có độ sạch đạt > 98%.
2. Đã chế tạo thành công hạt nanomangostin có khả năng phân tán tốt trong nước, có kích thước đạt < 50 nm, thế zeta đạt -38 mV, hàm lượng AMG bao gói đạt 2,90 mg/ml và hiệu quả bao gói đạt > 74,3%.
3. Hạt NMG tạo được phân tán tốt trong nước và vẫn duy trì được hoạt tính kháng tế bào ưng thư phổi A549 với IC50 đạt 4,86 g/ml, có khả nănng thâm nhập vào tế bào ung thư và ảnh hưởng đến kích thước nhân tế bào.
ĐỀ NGHỊ
- Tiếp tục tối ưu hạt NMG về kích thước, hiệu quả mang thuốc để đạt
hiệu quả tác dụng cao hơn.
- Đi sâu đánh giá cơ chế kháng ung thư đầy đủ của hạt nanomangostin trên các dòng tế bào ung thư khác nhau để khẳng định tiềm năng ứng dụng của hạt tổng hợp được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Tất Lợi, (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học Hà Nội, tr.567-568.
2. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thu Thùy, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Phùng Văn Trung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao (2010), Nghiên cứu quy trình tách chiết và hoạt tính kháng khuẩn của a-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia mangostana L. Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện KHCNVN – Hà Nội; tr.136-143.
3. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Quyền Đình Thi (2012), Hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của mangostin từ vỏ quả măng cụt. Tạp chí Dược liệu 2(7): 123-128.
4. Nguyễn Thị Mai Phương, (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kháng khuẩn lên các quá trình sinh lý và hóa sinh của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans”, Luận án tiến sỹ.
5. Nguyễn Thị Mai Phương và Marquis R.E, (2011), “Hoạt tính kháng vi khuẩn Streptococcus xoang miệng của α-mangostin tinh sạch từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)",Tạp chí Dược liệu,16(5): 298- 303.
6. Trần Thị Hải Yến, Nguyễn Hoài Nam, Lê Thị Thùy Dương, Hà Phương Thu, Hoàng Thị Mỹ Nhung, (2012),“Nghiên cứu khả năng điều trị ung thư của hệ nano kết hợp VX680 và Curcumin bọc trong copolymer TPGS (PLA-TPGS)”.Tạp chí Khoa học, 10: 223-229.
Tài liệu tiếng Anh
7. Aisha F, Ismail Z, Abu-Salah KM, Majid AM (2012), “Solid dispersions of α-mangostin improve its aqueous solubility through self-assembly of nanomicelles”, J Pharm Sci, 101(2): 815-825.
8. Anand P, Nair HB, Sung B, Kunnumakkara AB, Yadav VR, Tekma RR, Aggarwal BB (2010), “Design of curcumin-loaded PLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake, and increased bioactivity in vitro and superior bioavailability in vivo”,Biochem Pharmacol, 79: 330- 338.
9. Duchene D, Cavalli R, Gref R (2016), “Cyclodextrin-based polymeric nanoparticles as efficient carriers for anticancer drugs”, Curr Pharm Biotechnol, 17(3): 248-55.
10.Ee GC, Daud S, Taufiq-Yap YH, Ismail NH, Rahmani M (2006),
“Xanthones from Garcinia mangostana (Guttiferae)”,Nat. Prod. Res. 11.Ee GC, Daud S, Izzaddin SA, Rahmani M (2008), “Garcinia
mangostana: a source of potential anti-cancer lead compounds against CEM-SS cell line”, J Asian Nat Prod Res, 10(5-6): 475-479.
12. Frederick SO, Reinhard AK (2009) Basics of Oncology. Springer publishing
13. Ha PT, Duong TQ, Mai TTT, Tran THH, nguyen HN, Nguyen XP, Tran TM, Phan QT, Phan THT, Vuong TKO, Le MH (2013), “ In vitro apoptosis enhancement of Hep-G2 by PLA-TPGS and PLA-PEG block copolymers encapsulated Curcumin nanoparticles”, Chem letters 42(3): 255-257.
14.Heijmadi M. (2009) Introduction to cancer biology.
www.bookboon.com.
15.Koh JJ, Qiu S, Zou H, Lakshminarayanan R, Li J et al (2013), “ Rapid bactericidal action of alpha-mangostin against MRSA as an outcome of membrane targeting”,Biochim Biophys Acta (BBA), 1828(2): 834– 844.
16.Kwanggjae XC, Shuming B, Shuo C, Shin MD (2008), “ Therapeupeutic nanoparticles for drug delivery in cancer”, Clin Cancer Res, 14(4): 4-12.
17.Liechty WB, Kryscio DR, Slaughter BV, andPeppas NA (2010),
“Polymers for drug delivery systems”, Annu Rev Chem Biomol