Nhân tế bào ung thư phổi A549 sau khi xử lý với NMG và AMG tự do ở nồng độ IC50 sẽ được ủ với Hoechst 33342 ở nồng độ 1.6 uM. Sau khi ủ 30 phút, các tế bào được rửa với PBS và được quan sát dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser (IX71 inverted fluorescent microscope, Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan).
2.8. Xử lý thống kê
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t- test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu quy trình tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt
3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa AMG từ vỏ quả măng cụt
Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện thấy cây măng cụt, đặc biệt là vỏ quả và vỏ cây, chứa nhiều hợp chất phenol nhất là nhóm chất xanthone trong
đó có AMG [10]. Đến nay, đã có hơn 60 dẫn xuất xanthone khác nhau trong măng cụt được tinh sạch và xác định cấu trúc (Dictionary of Natural Products - DNP on CD-Rom). Mặc dù đã trở thành chế phẩm hóa chất thương mại trong thời gian gần đây, nhưng giá thành của chất này còn rất cao (150 USD/10 mg- Sigma). Trong khi đó, việc nghiên cứu sâu cũng như ứng dụng đòi hỏi cần một lượng chất lớn. Vì thế, việc tách và tinh sạch chúng từ nguồn nguyên liệu tự nhiên là cần thiết.
Để tinh sạch các xanthone, phần lớn các phòng thí nghiệm đều bắt đầu bằng việc sử dụng dịch chiết với ethanol hay methanol. Các xanthone sẽ được tinh sạch từ các dịch chiết này bằng phương pháp sắc ký trên các cột silica gel sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có tỉ lệ phân cực khác nhau để đẩy dần các chất này ra khỏi cột. Nhìn chung, để tinh sạch được một chất xanthone phải sử dụng thêm nhiều phương pháp sắc ký khác như sắc ký ngược pha, sắc ký trên cột sephadex LH-20, nên rất phức tạp và tốn kém. Nguyễn Thị Mai Phương (2005)[4] cũng đã tách được AMG từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:1:1. Tuy vậy, qui trình tách chiết chất này tỏ ra không hiệu quả mặc dù khá đơn giản vì hiệu suất thu hồi sản phẩm rất thấp. Các tác giả này cũng phát hiện thấy rằng các chất phenol có hoạt tính sinh học quan tâm là những chất có hệ số Rf lớn, nằm trong khoảng từ 0,8 đến 0,9 đồng nghĩa với việc chúng có tính phân cực thấp. Nhóm nghiên cứu này sau đó đã đơn giản hóa quá trình tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt bằng cách sử dụng những phân đoạn chiết trong dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như toluene, chloroform hay n-hexane nhằm loại bỏ phần lớn các chất không mong muốn khác có trong nguyên liệu ban đầu. Dung môi n-hexane đã được lựa chọn vì nó có điểm sôi thấp hơn (61oC) so với chloroform hay toluene (>100 oC) và cũng có hằng số lưỡng điện (dielectric constant) rất thấp (1,89 so với 4,81 của chloroform và 2,38 của toluene). Nhờ vậy, qui trình tinh sạch này
đã có hiệu suất cao hơn. Nhóm tác giả đã tinh sạch AMG sử dụng quy trình gồm các bước: i)tách chiết phân đoạn trong n-hexane; ii) sắc ký phân đoạn cao chiết n-hexane trên 2 cột silica gel liên tiếp sử dụng hệ dung môi rửa chiết n- hexane: ethyl acetate: methanol với gradient dung môi có tính phân cực tăng dần. Bằng quy trình này, AMG đã được tinh sạch hoàn toàn với hiệu suất thu hồi đạt 0,013% và độ sạch đạt > 96% [5]. Hiệu suất này cao hơn nhiều so với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng đã thực hiện trước đây [4]. Tuy nhiên, có thể thấy quy trình được đưa ra vẫn chưa đạt hiệu quả cao so với các quy trình đã được các tác giả khác công bố.
Với mục đích tìm ra được quy trình tinh sạch AMG tối ưu hơn, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch AMG từ phân đoạn chiết n- hexane sử dụng cột sắc ký silica gel với hệ dụng môi rửa chiết được thay đổi. Cụ thể như sau:
Bột nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô (2,0 kg) đã tiến hành chiết rút với ethanol bằng phương pháp ngâm chiết theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích ethanol trong 3 ngày để thu cao ethanol tổng số. Ethanol đã được khẳng định là dung môi phù hợp nhất để chiết rút polyphenol từ vỏ quả măng cụt xét về tiêu chí hiệu suất thu hồi cao chiết và hiệu quả kinh tế của quy trình thu nhận. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần. Dịch chiết sau đó được cô cất quay để thu cao ethanol tổng số. Khối lượng cao ethanol tổng số thu được từ thí nghiệm này là 153,6 g.
Để thu nhận phân đoạn chiết n-hexane, cao ethanol tổng số được hòa vào nước và tiến hành chiết phân đoạn với n-hexane trong phễu chiết. Phần phân đoạn n-hexane sau khi thu được quay cất khô chân không và cân để định lượng phân đoạn thu được. Trong thí nghiệm này, lượng cao phân đoạn n-hexane thu được là 8,2 g chiếm 0,41% so với khối lượng ban đầu.
Độ sạch của phân đoạn n-hexane được kiểm tra bằng phương pháp TLC trên bản silica gel (Hình 3.1) sử dụng hệ dung môi n-hexane : acetone theo tỉ lệ
3:1 với chất chuẩn AMG (Sigma) làm đối chứng. Kết quả thu được cho thấy phân đoạn n-hexane có chứa AMG và có độ sạch tăng lên rõ rệt so với dịch chiết tổng số trong ethanol (Hình 3.1).
1 2 3
Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n- hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi hexane: acetone (3:1). 1. Chất chuẩn; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân đoạn chiết n-hexane.
3.1.2. Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt
3.1.2.1. Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để chạy cột sắc ký silica gel
Để tinh sạch thành công chất nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký thì việc chọn lựa được hệ dung môi sắc ký thích hợp là hết sức quan trọng. Dựa trên kinh nghiệm và tham khảo các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phân tách phân đoạn n-hexane trên TLC sử dụng 3 hệ dung môi là n- hexane: ethyl acetate (2:1); n-hexane: ethyl acetate (3:1) và n-hexane: acetone (3:1). Kết quả thu được cho thấy hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1) là phù hợp nhất để tinh sạch AMG từ phân đoạn n-hexane.
1 2 3 A 1 2 3 B 1 2 3 C
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi: A)n- hexane: ethyl acetate (2:1); B)n- hexane: ethyl acetate (3:1); C) n-hexane: acetone (3:1). 1. Chất chuẩn; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân đoạn chiết n-hexane.
3.1.2.2. Tinh sạch AMG trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi n- hexane: acetone (3:1)
Phân đoạn n-hexane có khối lượng khoảng 8,2 g được đưa lên cột sắc ký silica gel có kích thước 3 x 80 cm và được rửa chiết với hệ dung môi n-hexane: acetone tỉ lệ 3:1 (v/v). Sau khi thu các phân đoạn 10 ml, độ sạch của các phân đoạn được xác định bằng TLC kết hợp so sánh với chất chuẩn. Kết quả cho thấy AMG được rửa ra khỏi cột ở phân đoạn từ 30 đến 42 (Hình 3.3). Các phân đoạn này sau đó được dồn lại và đông khô để xác định độ sạch, hiệu suất của quy trình thu nhận. Kết quả cho thấy sắc ký đồ TLC chỉ còn một băng duy nhất khi sử dụng cả hai hệ dung môi chạy TLC khác nhau là TEAF (5:3:1:1) và n- hexane: acetone (3:1). Điều này chứng tỏ chất thu được đã được tinh sạch (Hình
3.4). Quy trình này đã cho phép thu được 1,3 g chất tinh sạch với hiệu suất đạt 0,06%, cao hơn khoảng 5 lần so với quy trình đã được công bố trước đây [7].
Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1).
Hình 3.4 A. Sắc ký đồ AMG tinh sạch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung
môi n-hexane: acetone (3:1 v/v).1. Chất chuẩn; 2. Chất tinh sạch.
Hình 3.4 B. Sắc ký đồ AMG tinh sạch từ vỏ quả măng cụt
với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1 v/v).
0-35 40-80 80-95
1 2
Rf 0,82 Rf 0,85
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với detector DAD so sánh với mẫu AMG chuẩn cho thấy có một peak chính với thời gian lưu là 31,282 phút và độ sạch đạt tương đương với chất chuẩn > 98% (Bảng 3.1, Hình 3.5)
Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC của chất tinh sạch sau khi qua các cột sắc ký silicagel đo trên máy Hitachi – DAD L2455.
Bảng 3.1. Độ sạch của chế phẩm AMG so với chất chuẩn
Để khẳng định chính xác chất tinh sạch được chính là AMG chúng tôi đã tiến hành đo và phân tích phổ MS, phổ 1H và 13C của chất thu được trên máy cộng hưởng từ hạt nhân (Hình 3.6 A, B).
A
Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất AMG đo trên máy NMR Bruker, Avance 500
Bảng 3.2. Số liệu phân tích phổ 1H và 13C của AMG đã tinh sạch
Pos δCa,c δHa,d (mult., J = Hz)
1 159.8 - 2 109.9 - 3 162.2 - 4 92.2 6.34 (s, 1H) 4a 154.1 - 5 101.8 6.80 (s, 1H) 6 156.8 - 7 143.3 - 8 136.3 - 8a 109.6 - 9 181.2 - 9a 109.7 - 10a 154.5 - 11 20.9 3.22, 3.20 (d, 2H, J = 3.5Hz) 12 123.7 5.17 (m, 1H) 13 130.3 - 14 25.4 1.62 (s, 3H) 15 17.9 1.62 (s, 3H) 16 25.5 4.02, 4.01 (d, 2H, J = 5.0Hz) 17 122.5 5.15 (m, 1H) 18 130.2 - 19 17.6 1.73 (s, 3H) 20 25.7 1.77 (s, 3H) 1’ 60.1 3.70 (s, 3H) aMeasured in DMSO, c125 MHz, d500 MHz,
Hình 3.7. Phổ MS của chất AMG đo trên máy LC-MS, Avance 500
Kết hợp so sánh số liệu thu được trên (Hình 3.6, 3.7 và Bảng 3.2 với số liệu tham khảo) đã khẳng định chất tinh sạch được chính là AMG, có công thức hóa học là C24H26O6, có cấu trúc của một xanthone điển hình (Hình 3.8) và khối lượng phân tử là 410.
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của AMG (C24H26O6). A. Cấu trúc hóa học; B. Sản phẩm thu nhận được sau khi tinh sạch qua cột sắc ký
Toàn bộ qui trình tinh sạch AMG được tóm tắt trong sơ đồ ở hình 3.9.
Như vậy, sử dụng phương pháp tách chiết phân đoạn trong n-hexane kết hợp với sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi rửa cột n-hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1, chất AMG đã được tinh sạch với độ sạch đạt > 98%, hiệu suất thu hồi đạt 0,06% chỉ sau một lần sắc ký duy nhất. Hiệu suất này cao hơn nhiều so với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng và bằng quy trình sử dụng 2 cột sắc ký silica gel mà các tác giả trước đây đã công bố [4,5].
3.2. Chế tạo hạt nano polymer bọc mangostin (nanomangostin)-NMG 3.2.1. Tổng hợp hạt NMG 3.2.1. Tổng hợp hạt NMG
Đối với AMG, việc tổng hợp hạt mang AMG có kích thước nano cũng đã được công bố trong thời gian gần đây. Pan-In và cộng sự [22,23] đã tổng hợp thành công hạt nano mang AMG trên chất nền ethyl cellulose và methyl cellulose (ECMC) để xử lý Helycobacteria pillory và Propionibacterium acnes. Mặc dù các tác giả đã thu được hạt với hoạt tính sinh học mong muốn nhưng kích thước hạt vẫn tương đối lớn (> 500 nm) và độ bền của hạt cũng cần được cải thiện để có thể có ứng dụng hiệu quả hơn trong thực tế. Yao và cộng sự [29] đã thông báo tạo được hạt nano mang AMG sử dụng chất mang là polyethylene glycol–polylactic acid (PEG-PLA) để xử lý bệnh Alzheimer. Các tác giả đã tạo được hạt nano PEG–PLA có kích thước 94.26 ± 4.54 nm và có thế zeta là −32 ± 0.43 mV với khả năng phân tán đến các cơ quan như não và gan được cải thiện. Các tác giả cho rằng tổng hợp hạt nano mang AMG có thể là cách hữu hiệu cho việc ứng dụng của AMG để xử lý bệnh Alzheimer. Gần đây, Qiu và cộng sự [25] đã tạo được một hệ dẫn nano mới dựa trên hạt vàng. Hệ thống này được thiết kế để mang các chất có hoạt tính nhưng kỵ nước. Hệ thống là một tổ hợp kết hợp của hạt vàng/polyethyleneimine (AuNPs/PEI) và ß-cyclodextrin đã sulphat hóa (CD). Các chất cyclodextrin dạng anion được gắn vào các phân tử nano mang điện tích dương bằng các liên kết ion. AMG sau đó được bao gói vào các hạt nano AuNPs/PEI/CD này.
Hệ nano kết hợp này có kích thước khoảng 100 nm khi xác định dưới kính hiển vi TEM (transmission electron microscopy) và có thế zeta dương (+30 ± 3 mV). Điều thú vị là các nghiên cứu in vitro bước đầu cho thấy nó ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 và DU145 tốt hơn so với dạng AMG tự do. Rõ ràng là việc nano hóa đã giúp làm tăng độc tính tế bào của AMG. Như vậy, việc tạo hạt NMG trên thực tế đã bắt đầu được thực hiện và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên một vài mô hình in vitro. Tuy nhiên, có thể nhận thấy rằng các dạng hạt NMG tạo được chưa thật tối ưu về đặc tính hạt do chưa tối ưu được hệ dẫn (hệ dẫn còn phức tạp, các thông số hạt chưa thật tối ưu).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn cyclodextrin là vật liệu polymer bọc AMG. Đây là chất mang có cấu trúc đơn giản, mạch vòng, tan tốt trong nước và an toàn sinh học [9].
Quá trình tổng hợp hạt sẽ được thực hiện theo quy trình gồm 4 bước chính như sau:
Bước 1: AMG được hòa tan trong ethanol trong 30 phút ở tốc độ 400
- 500 vòng/phút sử dụng máy khuấy từ.
Bước 2: α, ß-cyclodextrin, hydroxy ß-cyclodextrin, Eudragit RS
100/RL 100 được hòa tan vào nước và được siêu âm 2 giờ trong bể siêu âm ở nhiệt độ phòng (Clifton model SW3H, Nikel-Electro - UK).
Bước 3: (tạo hạt micelle), AMG các dung dịch chất mang được trộn
theo tỉ lệ khác nhau trong 7 giờ ở nhiệt độ phòng sử dụng máy khuấy từ (ARE model, VELP, Italy).
Bước 4: dung dịch micelle được để qua đêm và ly tâm ở 5000g trong 10 phút để loại bỏ hạt không được bọc hay không phân bố đều trong nước.
Dung dịch hạt nanomangostin ở phần trên tủa được cất giữ ở nhiệt độ phòng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Tối ưu hóa các thông số tạo hạt NMG 3.2.2.1. Lựa chọn chất mang AMG 3.2.2.1. Lựa chọn chất mang AMG
Chất mang cyclodextrin dạng α và β, hydroxy ß-cyclodextrin và eudragit RS100 /RL100 đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Dạng hydroxyl và α - cyclodextrin có độ tan trong nước cao hơn dạng beta. Vì thế, chúng tôi cho rằng chất mang hydroxyl và α-cyclodextrin sẽ ưu việt hơn beta khi tổng hợp hạt. Các nghiên cứu mới công bố của Pignatello và cộng sự [21] cho thấy Eudragit RS100 /RL100 cũng là chất mang khá tốt. Tuy nhiên, kết quả thu được (Bảng 3.3) đã không như chúng tôi dự đoán. Dạng β - cyclodextrin cho hiệu quả tạo hạt tốt hơn hẳn dạng hydroxy ß-cyclodextrin và α - cyclodextrin thể hiện ở chỗ hệ hạt thu được có độ tan tốt hơn (không bị kết tủa sau 10 ngày chế tạo) và kích thước nhỏ hơn. Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn β- cyclodextrin cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Đánh giá hiệu quả mang AMG của các chất nghiên cứu
Chất mang Kích thước (nm) Hàm lượng AMG (mg/ml) Độ tan
(sau 10 ngày chế tạo)
α - cyclodextrin 120 0,3 Xuất hiện tủa
β - cyclodextrin 50 0,6 Không tủa
Hydroxy ß- cyclodextrin
150 0,4 Xuất hiện tủa
Eudragit RS100 /RL100
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ chất mang ß- cyclodextrin và AMG
Để đánh giá hiệu quả mang (tải trọng mang AMG) của ß-cyclodextrin, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp hạt NMG sử dụng các tỉ lệ chất mang và hoạt chất khác nhau là 1:1; 1:2.5 và 1:5. Kết quả được trình bày tại bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ trộn của chất mang β- cyclodextrin và AMG lên các thông số hạt
Tỉ lệ phối trộn chất mang và AMG Hàm lượng AMG (mg/ml) tại A243 1:1,0 0,45 1:2,5 2,54 1:5,0 1,01
Số liệu bảng 3.4 cho thấy công thức phối trộn 1: 2,5 cho kết quả tốt nhất, thể hiện ở chỗ hàm lượng AMG cao nhất, đạt 2,54 mg/ml so với 0,45 mg/ml (tỉ