3.2.1. Tổng hợp hạt NMG
Đối với AMG, việc tổng hợp hạt mang AMG có kích thước nano cũng đã được công bố trong thời gian gần đây. Pan-In và cộng sự [22,23] đã tổng hợp thành công hạt nano mang AMG trên chất nền ethyl cellulose và methyl cellulose (ECMC) để xử lý Helycobacteria pillory và Propionibacterium acnes. Mặc dù các tác giả đã thu được hạt với hoạt tính sinh học mong muốn nhưng kích thước hạt vẫn tương đối lớn (> 500 nm) và độ bền của hạt cũng cần được cải thiện để có thể có ứng dụng hiệu quả hơn trong thực tế. Yao và cộng sự [29] đã thông báo tạo được hạt nano mang AMG sử dụng chất mang là polyethylene glycol–polylactic acid (PEG-PLA) để xử lý bệnh Alzheimer. Các tác giả đã tạo được hạt nano PEG–PLA có kích thước 94.26 ± 4.54 nm và có thế zeta là −32 ± 0.43 mV với khả năng phân tán đến các cơ quan như não và gan được cải thiện. Các tác giả cho rằng tổng hợp hạt nano mang AMG có thể là cách hữu hiệu cho việc ứng dụng của AMG để xử lý bệnh Alzheimer. Gần đây, Qiu và cộng sự [25] đã tạo được một hệ dẫn nano mới dựa trên hạt vàng. Hệ thống này được thiết kế để mang các chất có hoạt tính nhưng kỵ nước. Hệ thống là một tổ hợp kết hợp của hạt vàng/polyethyleneimine (AuNPs/PEI) và ß-cyclodextrin đã sulphat hóa (CD). Các chất cyclodextrin dạng anion được gắn vào các phân tử nano mang điện tích dương bằng các liên kết ion. AMG sau đó được bao gói vào các hạt nano AuNPs/PEI/CD này.
Hệ nano kết hợp này có kích thước khoảng 100 nm khi xác định dưới kính hiển vi TEM (transmission electron microscopy) và có thế zeta dương (+30 ± 3 mV). Điều thú vị là các nghiên cứu in vitro bước đầu cho thấy nó ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 và DU145 tốt hơn so với dạng AMG tự do. Rõ ràng là việc nano hóa đã giúp làm tăng độc tính tế bào của AMG. Như vậy, việc tạo hạt NMG trên thực tế đã bắt đầu được thực hiện và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên một vài mô hình in vitro. Tuy nhiên, có thể nhận thấy rằng các dạng hạt NMG tạo được chưa thật tối ưu về đặc tính hạt do chưa tối ưu được hệ dẫn (hệ dẫn còn phức tạp, các thông số hạt chưa thật tối ưu).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn cyclodextrin là vật liệu polymer bọc AMG. Đây là chất mang có cấu trúc đơn giản, mạch vòng, tan tốt trong nước và an toàn sinh học [9].
Quá trình tổng hợp hạt sẽ được thực hiện theo quy trình gồm 4 bước chính như sau:
Bước 1: AMG được hòa tan trong ethanol trong 30 phút ở tốc độ 400
- 500 vòng/phút sử dụng máy khuấy từ.
Bước 2: α, ß-cyclodextrin, hydroxy ß-cyclodextrin, Eudragit RS
100/RL 100 được hòa tan vào nước và được siêu âm 2 giờ trong bể siêu âm ở nhiệt độ phòng (Clifton model SW3H, Nikel-Electro - UK).
Bước 3: (tạo hạt micelle), AMG các dung dịch chất mang được trộn
theo tỉ lệ khác nhau trong 7 giờ ở nhiệt độ phòng sử dụng máy khuấy từ (ARE model, VELP, Italy).
Bước 4: dung dịch micelle được để qua đêm và ly tâm ở 5000g trong 10 phút để loại bỏ hạt không được bọc hay không phân bố đều trong nước.
Dung dịch hạt nanomangostin ở phần trên tủa được cất giữ ở nhiệt độ phòng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Tối ưu hóa các thông số tạo hạt NMG 3.2.2.1. Lựa chọn chất mang AMG 3.2.2.1. Lựa chọn chất mang AMG
Chất mang cyclodextrin dạng α và β, hydroxy ß-cyclodextrin và eudragit RS100 /RL100 đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Dạng hydroxyl và α - cyclodextrin có độ tan trong nước cao hơn dạng beta. Vì thế, chúng tôi cho rằng chất mang hydroxyl và α-cyclodextrin sẽ ưu việt hơn beta khi tổng hợp hạt. Các nghiên cứu mới công bố của Pignatello và cộng sự [21] cho thấy Eudragit RS100 /RL100 cũng là chất mang khá tốt. Tuy nhiên, kết quả thu được (Bảng 3.3) đã không như chúng tôi dự đoán. Dạng β - cyclodextrin cho hiệu quả tạo hạt tốt hơn hẳn dạng hydroxy ß-cyclodextrin và α - cyclodextrin thể hiện ở chỗ hệ hạt thu được có độ tan tốt hơn (không bị kết tủa sau 10 ngày chế tạo) và kích thước nhỏ hơn. Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn β- cyclodextrin cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Đánh giá hiệu quả mang AMG của các chất nghiên cứu
Chất mang Kích thước (nm) Hàm lượng AMG (mg/ml) Độ tan
(sau 10 ngày chế tạo)
α - cyclodextrin 120 0,3 Xuất hiện tủa
β - cyclodextrin 50 0,6 Không tủa
Hydroxy ß- cyclodextrin
150 0,4 Xuất hiện tủa
Eudragit RS100 /RL100
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ chất mang ß- cyclodextrin và AMG
Để đánh giá hiệu quả mang (tải trọng mang AMG) của ß-cyclodextrin, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp hạt NMG sử dụng các tỉ lệ chất mang và hoạt chất khác nhau là 1:1; 1:2.5 và 1:5. Kết quả được trình bày tại bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ trộn của chất mang β- cyclodextrin và AMG lên các thông số hạt
Tỉ lệ phối trộn chất mang và AMG Hàm lượng AMG (mg/ml) tại A243 1:1,0 0,45 1:2,5 2,54 1:5,0 1,01
Số liệu bảng 3.4 cho thấy công thức phối trộn 1: 2,5 cho kết quả tốt nhất, thể hiện ở chỗ hàm lượng AMG cao nhất, đạt 2,54 mg/ml so với 0,45 mg/ml (tỉ lệ 1:1,0) và 1,01 mg/ml (tỉ lệ 1:5,0). Vì thế, công thức này đã được lựa chọn để tổng hợp hạt nanoplymer bọc AMG cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.3. Xác định thông số hạt NMG sử dụng chất mang ß- cyclodextrin
Sử dụng công thức tạo hạt đã được thiết lập ở trên, dung dịch nano NMG thu được có màu vàng trong suốt (Hình 3.10)
Hình 3.10. Dung dịch NMG thu được sử dụng chất mang ß- cyclodextrin
Dung dịch AMG trong nước Dung dịch
Các thông số vật lý của hạt cũng đã được kiểm tra và cho các kết quả như sau:
Hình thái và kích thước hạt nanomangostin: Các thông số này được xác định sử dụng máy DLS và kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE- SEM. Kết quả đo trên máy DLS (Hình 3.10) cho thấy hạt NMG thu được có kích thước đạt 50 nm với mật độ > 60%.
Hình 3.11. Kích thước hạt NMG đo trên máy DLS
Kết quả chụp FE-SEM (Hình 3.12A) và kính hiển vi đồng tụ quét lasercũng cho thấy hạt NMG thu được có kích thước < 50 nm có khả năng tự phát quang màu xanh lục (green) tại bước sóng vùng 500-600 nm khi bị kích thích ở vùng ánh sáng 400 nm (Hình 3.12B). Như vậy các kết quả kích thước hạt NMG đo từ DLS là phù hợp với kết quả FE-SEM.
Hình 3.12A. Ảnh chụp FE-SEM hạt NMG
Hình 3.12B. Ảnh chụp kính hiển vi đồng tụ quét laser hạt NMG
Xác định thế zeta
Hạt NMG được xác định điện tích bề mặt và đo độ phân bố hạt sử dụng máy DLS. Theo lý thuyết thì các hạt có thế zeta > - 40 mV là bền. Trong nghiên cứu này, thế zeta của NMG đạt -38 mV, gợi ý hạt NMG thu được có độ bền tốt (Hình 3.13).
Hình 3.13. Thế zeta của hạt NMG đo trên máy DLS 3.3.
3.2.2.4. Hiệu quả bao gói của hạt NMG
Hàm lượng AMG trên hạt được xác định sử dụng hệ thống khối phổ LC- MS. Các kết quả thu được cho thấy NMG đã được tổng hợp thành công vì có một đỉnh xuất hiện với thời gian lưu (retention time) là 25.3 - 25.6 min cho cả NMG và AMG (số liệu không trình bày). Hàm lượng AMG trong dung dịch hạt nano đạt 2,90 0,25 mg/ml. Hiệu quả bao gói của hạt AMG cũng được xác định dựa trên tỉ lệ giữa hàm lượng AMG đo được của hạt NMG và hàm lượng NMG sử dụng để tổng hợp hạt. Kết quả cho thấy hiệu quả bao gói đạt 74,3%.
3.2.2.5 Tác dụng kháng tế bào ung thư phổi A549
Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã cho thấy AMG có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư, trong đó có dòng tế bào
ung thư phổi A549 [13]. Để tìm hiểu xem liệu tương tác của AMG với ß- cyclodextrin có làm ảnh hưởng đến hoạt tính của NMG hay không, hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi A549 của NMG đã được kiểm tra ở các nồng độ khác nhau 0; 2,5; 5,0; 10; 20,0 μg/ml. Các kết quả thu được ở hình 3.14 cho thấy NMG thể hiện hoạt tính gây độc mạnh lên các tế bào ung thư theo cách phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 đạt 4,86 µg/mL. Giá trị IC50 của AMG đạt 2,34 µg/ml. Dung dịch chất mang ß-cylodextrin cũng được kiểm tra độc tính trên dòng tế bào này. Kết quả cho thấy ß-cylodextrin không thể hiện hoạt tính gây độc (số liệu không trình bày).
Hình 3.14. Hoạt tính gây độc tế bào của NMG tan trong nước lên dòng tế bào ung thư A549. NMG () và AMG (). Các tế bào ung thư (105 tế bào/ml) được xử lý với các nồng độ chất khác nhau (NMG tan trong nước; AMG tan
trong DMSO).
Như vậy, NMG đã thể hiện hoạt tính kháng ung thư in vitro gần tương tự với AMG tự do tan trong DMSO. Điều đó chứng tỏ NMG đã phân tán tốt trong nước và thể hiện hoạt tính của chất AMG. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của hạt nano mang các chất tự nhiên cũng đã được công bố, trong đó có các chất tự nhiên như curcumin, parlitaxel… [6, 8, 22, 29]. Có thể thấy rằng việc tạo hạt nano bọc chất tự nhiên là hướng tiếp cận mới và khả thi để tăng sinh khả dụng và ứng dụng của chúng.
A5
4
9
3.2.2.6.Khả năng xâm nhập của NMG vào tế bào ung thư phổi
Kết quả quan sát sự phát quang của AMG và NMG trong tế bào ung thư đã xử lý với các chất này so với đối chứng tại bước sóng 485nm ở hình 3.15 đã cho thấy tế bào đối chứng không có khả năng phát quang trong khi tế bào được xử lý với AMG và NMG có khả năng này. Tế bào xử lý NMG có khả năng phát quang mạnh hơn tế bào xử lý AMG, gợi ý rằng NMG đã được xâm nhập tốt hơn vào tế bào. Điều đó cũng giải thích tại sao NMG có khả năng gây độc tế bào A549.
A B C
Hình 3.15. Khả năng xâm nhập của NMG vào tế bào ung thư phổi. (A). Đối chứng; (B). Xử lý AMG (2µg/ml); (C) xử lý NMG (2µg/ml).
3.2.2.7. Kích thước nhân tế bào khi xử lý với NMG
Quan sát hình thái nhân tế bào ung thư phổi dưới kính hiểm vi đồng tụ quét laser sau khi nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang Hoesch cho thấy ở mẫu xử lý chất AMG kích thước nhân không có nhiều khác biệt so với mẫu đối chứng. Trong khi đó, ở mẫu xử lý tế bào NMG thì tế bào nhân to hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Điều đó chứng tỏ NMG đã xâm nhập vào nhân tế bào và đã ảnh hưởng đến kích thước của nhân.
A B C
Hình 3.16. Hình thái nhân tế bào khi xử lý với AMG và NMG (A). Đối chứng; (B). Xử lý AMG; (C) xử lý NMG.
Trong số nhiều giải pháp khác nhau đối với các hệ thống dẫn truyền thuốc tới các vị trí bệnh, có hai giải pháp được quan tâm nhất là: i) tích thuốc tại các vị trí bệnh của hướng đích thụ động dựa vào tính thấm dễ dàng của các chất mang thuốc trong máu; ii) hướng đích chủ động dựa vào sự gắn các phối tử đặc biệt lên bề mặt chất mang để nhận ra và liên kết với các tế bào bệnh.
Nguyên tắc của việc nhả thuốc theo cơ chế thụ động là dựa trên việc môi trường xung quanh khối u có nhiều điểm khác biệt so với tế bào lành. Sự khác nhau về độ pH giữa tế bào ung thư và tế bào lành là: tế bào ung thư có độ pH thấp (2 - 3); có nhiệt độ cao (38 - 40oC) và trên bề mặt có rất nhiều loại vitamin (nhiều nhất là nhóm B9), trong khi đó các tế bào thường có pH và nhiệt độ tương ứng trong khoảng 7,2 - 7,4 và 36,5 - 37oC. Các tế bào của khối u có mức độ trao đổi chất cao nên sử dụng quá trình đường phân để nhận thêm năng lượng, hình thành các axit hữu cơ làm giảm pH của môi trường xung quanh tế bào u. Cấu trúc các hạt nano dẫn thuốc rất nhạy cảm với pH. Chúng ổn định ở pH sinh lý là 7,2 - 7,4 nhưng sẽ bị phân giải trong môi trường pH thấp hơn giá trị sinh lý này. Khi đó thuốc sẽ được giải phóng tại mô đích.
Một đặc điểm quan trọng nữa giúp tăng cường hiệu quả tác dụng đối với hệ dẫn truyền thụ động là kích cỡ của hạt nano và sự phân bố kích cỡ vì chúng
liên quan đến các đặc điểm của khối u. Môi trường khối u là một môi trường phức tạp, nơi bất bình thường về giải phẫu và sinh lý học. Sự phát triển của tế bào ung thư không được kiểm soát và sự tiết các yếu tố tạo mạch dẫn đến hệ mạch máu phát triển vô tổ chức và các môi trường ngoại mạch dày đặc. Những khiếm khuyết cấu trúc này là nguyên nhân của hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (Enhanced permeability DNA retention effect - EPR), là nguồn gốc của sự tích lũy và lưu trữ không đồng đều các vât liệu nano trong khối u. Sự mất cân bằng trong điều hòa tăng sinh mạch máu dẫn đến kết quả là các nhân tố sinh trưởng sẽ làm cho mạch máu khối u mất tổ chức và thủng rất nhiều lỗ, tạo khoảng cách giữa các tế bào nội mô và làm thoát mạch. Kích thước các lỗ mạch của các vi mạch máu khối u dao động từ 100 đến 500 nm [27]. Do đó, kích thước hạt nano đóng một vai trò quan trọng trong tích lũy khối u thông qua hiệu ứng EPR. Kích thước của hạt nano sử dụng trong một hệ thống phân phối thuốc cần đủ lớn để ngăn chặn sự rò rỉ nhanh chóng ở các mạch máu, nhưng phải đủ nhỏ để không bị hệ miễn dịch đào thải. Vì vậy, để tận dụng hiệu ứng EPR và thoát khỏi hàng rào miễn dịch, nhiều nghiên cứu đã đưa ra phạm vi kích thước hạt nano tối ưu khoảng 10-250 nm.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, hạt NMG đã được tổng hợp thành công và thể hiện được những ưu việt hơn so với các hạt nano đã công bố trước đây và so với dạng chất chưa nano hóa. Điều này được thể hiện ở các điểm sau:
Trước hết, tính tan trong nước là tiêu chí lý tưởng của một chất có thể dùng làm thuốc. Khả năng tan tốt trong nước của NMG rõ ràng là đặc điểm ưu việt của chất này so với dạng tự nhiên.
Về kích thước, hạt NMG tạo được có kích thước < 50 nm sử dụng hệ dẫn đơn giản những vẫn đảm bảo độ bền của hạt. Với kích thước hạt này, NMG có thể lọt được các lỗ mạch trong các khối u ung thư theo hướng vận chuyển thuốc thụ động, tận dụng hiệu ứng EPR và thoát khỏi hàng rào miễn dịch.
Các kết quả về hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư phổi A549 thu được của hạt NMG chứng tỏ tương tác của AMG với chất mang dường như đã không làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất này. Vì vậy, hoạt tính sinh học của chất tự nhiên vẫn được duy trì.
Tóm lại, hạt NMG sinh tổng hợp được đã chứng tỏ khả năng gây độc tế bào ung thư phổi mạnh và có triển vọng ứng dụng. Mặc dù vậy, các nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành để tối ưu công thức tạo hạt cũng như chứng minh đầy đủ cơ chế tác dụng của hạt tạo được, làm cơ sở để ứng dụng chứng trong điều trị bệnh.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã đưa ra được qui trình tinh sạchα-mangostin đơn giản từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) gồm 2 bước chính là: i) chiết phân đoạn với n-hexane và ii) sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : accetone theo tỉ lệ 3:1. Chất thu được có độ sạch đạt > 98%.
2. Đã chế tạo thành công hạt nanomangostin có khả năng phân tán tốt trong nước, có kích thước đạt < 50 nm, thế zeta đạt -38 mV, hàm lượng AMG bao gói đạt 2,90 mg/ml và hiệu quả bao gói đạt > 74,3%.
3. Hạt NMG tạo được phân tán tốt trong nước và vẫn duy trì được hoạt