Phương pháp thu mẫu

Tổng số 268 mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của 10 quần thể loài Dầu nước và 10 mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của 10 loài dầu khác được thu, đánh số và bảo quản trong silica gel ngoài thực địa. Sau đó được chuyển về phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, các mẫu được bảo quản trong tủ lạnh -300C cho đến khi mẫu được lấy ra để phân tích DNA. Mẫu tiêu bản cũng được thu thập tại thực địa và được bảo quản trong phòng thí nghiệm

2.3.3 Phân tích trong phòng thí nghiệm 2.3.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle (1987) [16], có cải tiến theo phòng thí nghiệm bao gồm các bước sau:

Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá (hoặc vỏ cây). Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, chuyển ngay bột mịn vào ống eppendorf 2ml.

Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4

0,5%) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).

Bước 3: Bổ sung 800l đệm tách chiết (NaCl 1,5M, Tris-HCl 100mM, EDTA 20mM, CTAB 4%) wotex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở 650C thỉnh thoảng trộn đều. Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Bước 4: Bổ sung 800l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C, hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần).

Bước 5: Bổ sung 1 lần thể tích isopropanol đảo đều để ở tủ -200C 1 giờ. Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa.

Bước 6: Rửa tủa bằng ethanol 70%. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C.

Bước 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50-100 l TE.

Bước 8: Bổ sung 3l RNase(10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ.

Bước 9: Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% (lạnh), đảo nhẹ để trong tủ -200C trong 30 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu tủa.

Bước 10: Rửa tủa bằng ethanol 70%. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C.

Bước 11: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50-100 l TE. DNA tổng số được kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA bằng đo quang phổ hấp thụ bước sóng 260nm và 280nm kết hợp với điện di trên gel agarose 0,8%. Sau đó pha loãng về nồng độ 10ng/l.

2.3.3.2 Thiết kế mồi

a. Mồi SSR: để phân tích đa dạng di truyền quần thể, 15 cặp mồi SSR đã được tiến hành nghiên cứu, trong đó 9 cặp mồi cho kết quả tốt nhất đã được lựa chọn và sử dụng trong phân tích (Bảng 2.3). Tham khảo từ Isagi et al., 2002; Terauchi, 1994; Ujino et al., 1998 [25, 55, 58].

Bảng 2.3. Các cặp mồi SSR đã được sử dụng trong phân tích

T T Lô cút Số lần lặp lại Trình tự mồi xuôi và mồi ngược (5’ – 3’) Kích thước sản phẩm PCR Nhiệt độ bắt cặp Tài liệu tham khảo 1 Dipt01 (AG)15 F-CTTCCCTAAATTCCCCAATGTT 193 55oC Isagi et al., 2002 R-TAATGGTGTGTGTACCAGGCAT

2 Dipt03 (GA)24 F-ACAATGAAACTTGACCACCCAT 226 56oC Isagi et al., 2002 R-CAAAAGGACATACCAGCCTAGC 3 Dipt04 (AG)15 F-TAGGGCATATTGCTTTCTCATC 214 55oC Isagi et al., 2002 R-CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA 4 Dipt05 (GA)25 F-TCTCAAAATCTGCAAAGACAGC 293 55oC Isagi et al., 2002 R-CCATAGTCATCACCTCTAATGGTC 5 Dipt06 (TA)8 F-TGGCAAACAAGCTACTGTTCAT 258 55oC Isagi et al., 2002 R-CATGGGTTTAGCAACCTACACA 6 Dipt07 (AC)9 F-CAGGAGGGGAATATGGAAAA 120 54oC Isagi et al., 2002 R-AAGTCGTCATCTTTGGATTGC 7 Dipt08 (GA)6 F-ATGCTTACCACCAATGTGAATG 170 55oC Terauchi, 1994 R-CTCGCAGCAGAACAACTTTCTA 8 Shc07 (CT)8CA(CT)5C ACCC(CTCA)3 CT(CA)10

F-ATGTC CATGT TTGAG TG

169 54oC Ujino et al.,

1998

R-CATGG ACATA AGTGG AG

9 Shc11

(CT)4TT

(CT)5

F-ATCTG TTCTT CTACA AGCC

166 54oC Ujino et al.,

1998

R-TTAGA ACTTG AGTCA GÂTC

b. Mồi cho khuếch đại gen matK: Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự DNA gen matK thuộc hệ gen lục lạp của loài Dipterocarpus palembanicus lấy từ ngân hàng gen (mã số: AB295903). Các mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ, nằm hai đầu của vùng gen nghiên cứu. Các mồi được thiết kế sao cho đạt được mồi phổ biến, tức là có thể khuyếch đại phản ứng PCR trên nhiều loài khác nhau thuộc các chi khác trong họ dầu, tuy nhiên ưu tiên cho các loài thuộc chi

Dipterocarpus. Trình tự mồi được thiết kế với sự trợ giúp của phần mềm thiết kế mồi primerselect trong phần mềm DNASTAR. Trên cơ sở đó, nghiên cứu đã thiết kế được 2 cặp mồi matK3 và matK5 cho việc thực hiện phản ứng PCR cây họ Dầu (Bảng 2.4).

Bảng 2.4. Trình tự cặp mồi thiết kế để xác định trình tự nucleotide gen matK

Ký hiệu mồi Sản phẩm PCR Trình tự nucleotide Nhiệt độ nóng chảy Thành phần GC matK3F 650 bp 5’-GGGAAATTCCATTTTCCCTAC-3’ 600C 42,8% matK3R 5’-GGATGCCCTACTGCGTTACA-3’ 620C 55%

matK5F

600 bp 5’-TTATAGGGAAACAAAAAGCAACGAG-3’ 680C 36% matK5R 5’-CAGATGGATGGGATGAGGTATTAG-3’ 700C 45,8%

Với sự kết hợp của 2 cặp mồi nêu trên có thể xác định được trình tự nucleotide gen matK dài khoảng 1200bp cho các loài nghiên cứu.

2.3.3.3 PCR

a. PCR cho SSR. Thể tích mỗi phản ứng PCR là 25 µl, trong đó chứa các thành phần gồm dung dịch đệm 1x PCR; 2,5mMgCl2, 2mM dNTPs; 0,5 pmol cho mỗi mồi xuôi hoặc ngược; 50ng DNA tổng số và 0,5U Taq polymerase. Quá trình nhân bản được tiến hành trên máy Gene amp PCR system 9700 theo chu trình nhiệt sau: (1) Biến tính ban đầu: 940C trong 3 phút; (2) Biến tính: 940C trong 1 phút; (3) Bắt cặp: 54-560C tùy theo mỗi cặp mồi, trong 1 phút; (4) Kéo dài: 720C trong 1 phút; (5) Lặp lại (2) đến (4): 40 chu kỳ; (6) Phản ứng kết thúc hoàn toàn: 720C trong 10 phút; (7) Giữ sản phẩm ở 40C.

b. PCR cho nhân bản gen matK. Phản ứng nhân gen được thực hiện trong thể tích là 25µl với các thành phần gồm có: Master Mix Dream Taq Green 2X: 12,5l; MgCl2 25mM: 1l; Taq polymerase 5u/l: 0,5l; 10 ng/l DNA mẫu: 2l; primer 10pmol mỗi mồi xuôi hoặc ngược: 1,25l, H2Odeion: 7µl. Chu trình nhiệt của mỗi phản ứng PCR: (1) 950C 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 950C 30 giây; 560C 1phút; 720C 1phút. Cuối cùng là 720C 10 phút để kết thúc phản ứng và giữ mẫu ở 40C.

Phản ứng được thực hiện trên máy PCR system 9700.

2.3.3.4 Điện di

a. Điện di Gel Polyacrylamide. Điện di sản phẩm PCR trên gel Polyacrylamide 5% trong 40 ml dung dịch đệm 1xTAE, nhuộm bằng Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel của hãng CLEARVER.

Các bước tiến hành pha nông độ gel polyacrylamide như sau:

- Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gồ m bis-acrylamide), 1x TBE, 10% ammonium persulphate.

- Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đêṃ bằng KOH/methanol hoặc ethanol. Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong.

- Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm.

- Bổ sung 35µl TEMED vào mỗi 100 ml dung dịch tạo polyacrylamide gel, trộn hỗn hợp bằng cách vortex. Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính. Gắ n nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược (giếng). Đỉnh của răng lược phải hơi cao hơn mép gel. Nếu cần, bổ sung một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mép gel.

- Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ trong phòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều.

- Sau khi polymer hó a hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính ra khỏi đáy khuôn gel. Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm 1x TBE, dùng pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm 1x TBE.

- Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6x gel-loading dye. Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette.

- Đưa bản gel vào bể điện di và chạy trong khoảng 20 phút. Soi gel dưới đèn UV.

b. Điện di Gel Agarose. Điện di DNA trên gel Agarose là phương pháp sử dụng trong cả phân tích định tính và định lượng mẫu DNA. Do đó, điện di Gel Agarose luôn được sử dụng cho sản phẩm sau khi tách DNA tổng số và các sản phẩm PCR. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang.

Cách pha Agarose 1%:

- Cho 0,4g agarose vào 40ml đệm TAE 1X hòa tan bằng cách đun hỗn hợp trong lò vi sóng khoảng 1 phút.

- Khi gel nguội đạt khoảng 60ºC, bổ sung vào dung dịch gel 4µl EB (10 g/ml), lắc đều, đổ hỗn hợp gel – EB vào giá thể đã cắm sẵn các lược tạo giếng phù hợp với số lượng mẫu.

- Để gel khô, khi gel đã khô, rút lược.

- Dùng pipet lấy 10µl mẫu, mix đều vơi 1µl mầu nhuộm điện di (brommophenol blue + glycerol) (loading dye) trên giấy paraffin trước khi tra vào giếng trên bản gel. Việc nhuộm màu điện di giúp ta nhận biết mẫu và làm mẫu lắng xuống đáy giếng, tránh bị nổi lên khi cho vào bể điện di. - Đưa bản gel vào bể điện di và chạy trong khoảng 20 phút ở 100v, 30A.

Soi gel dưới đèn UV. Các phân tử DNA sẽ bắt màu với EB trong gel agarose sẽ hiện lên với các vạch màu dưới đèn UV.

2.3.3.5 Giải mã vùng gen

Đây là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng. Có hai phương pháp xác định vị trí nucleotide của phân đoạn DNA khác nhau được phát triển đồng thời, đó là phương pháp xác định trình tự của Sanger (Anh) [48] và phương pháp phân hủy hóa học của Maxam và Gilbert (Mỹ) [41]. Cả hai phương pháp đều cho phép đọc trình tự với độ dài vài kb trong thời gian ngắn nhất.

Trong nghiên cứu này, việc đọc trình tự cả 2 chiều (xuôi và ngược) của vùng gen matK được tiến hành theo phương pháp Sanger và được thực hiện bởi công ty Macrogen, Hàn Quốc.

2.4 Phân tích số liệu

2.4.1 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước

Đánh giá các thông số đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) nghiên cứu: Tần số alen, số alen trung bình (A) cho mỗi lô cút, hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng (He), hệ số tương đồng và hệ số khoảng cách di truyền giữa các quần thể được thực hiện bằng phần mềm GenAIEx (Peakall và Smouse, 2006) [46]. Các hệ số thống kê F (Fst, Fis) và dòng gen (Nm) giữa các quần thể cũng được thực hiện dựa trên phần

mềm FSTAT (Goudet, 2002) [21]. Việc kiểm định giả thiết sự cho các lô cút đa hình và giữa các quần thể được thực hiện ở mức ý nghĩa p=0,05 và phân tích AMOVA (variance components in the analysis of molecular variance) nhằm xác định sự khác biệt di truyền giữa các quần thể nghiên cứu được phân tích trên phần mềm Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005) [17]. Mối quan hệ giữa các quần thể trên cơ sở khoảng cách di truyền có được nhờ sử dụng phần mềm TFPGA (Miller, 1997) [42].

2.4.2 Mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu

So sánh sự khác nhau về vị trí các nucleotide giữa các cặp loài trên cơ sở trình tự nucleotide của gene matK bằng phần mềm GenDoc 2.5 (Nicholas và Nicholas, 1997) [44]. Kiểm tra và ghép nối các đoạn gen matK được thực hiện bởi phần mềm ChromasPro (Technelysium Pty Ltd) [http://www.technelysium.com.au/.ChromasPro.html]. Thành phần base (%) vùng gen matK của các loài nghiên cứu, sự khác nhau giữa các cặp loài trên cơ sở phân tích theo mô hình Kimura 2 tham số và sơ đồ hình cây mối quan hệ di truyền theo hai phương pháp: NJ (Neighbour-Joining) và MP (Maximum parsimony) được tiến hành trên phần mềm MEGA4 (Tamura et al., 2007) [53] và Paup* (Swofford, 1993) [50].

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nơi sống, cấu trúc phân tầng rừng, hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự nhiên tự nhiên

3.1.1 Nơi sống và cấu trúc phân tầng rừng

3.1.1.1 VQG Cát Tiên, rừng Vĩnh Cửu và Khu Bảo tồn thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai (tỉnh Đồng Nai).

VQG Cát Tiên: nằm ở tọa độ 11o20’50” đến 11o50’20” vĩ độ Bắc và 107o09’05” đến 107o35’20” kinh độ Đông. Phía Bắc và phía Tây giáp với tỉnh Đắk Lắk và huyện Bù Đăng tỉnh Bình Phước. Phía Nam giáp với Khu quản lý Bảo tồn Thiên nhiên và văn hóa Đồng Nai, phía Đông giáp với sông Đồng Nai và các huyện Cát Tiên, Bảo Lộc. Về mặt địa hình, VQG Cát Tiên là vùng chuyển tiếp từ các cao nguyên cực Nam Trung Bộ đến đồng bằng Nam Bộ. VQG gồm 5 kiểu địa hình. Địa hình núi cao, sườn dốc với độ cao từ 200-600m và độ dốc 15-20o, chiếm chủ yếu ở phía Bắc của VQG. Địa hình đồi núi trung bình và sườn ít dốc với độ cao 200-300m, với độ dốc khoảng 15o và tập trung ở phía Nam vườn. Kiểu địa hình đồi thấp bằng phẳng với độ cao 150 m, độ dốc 5- 7o tập trung ở phía Đông Nam vườn. Địa hình bậc thềm sông Đồng Nai chạy dài từ ranh giới Đồng Nai - Sông Bé và chạy dọc sông Đồng Nai đến Tà Lài, với độ cao 130m. Và cuối cùng, địa hình thềm suối xen kẽ với hồ đầm với độ cao dưới 130m. Về mặt thổ nhưỡng gồm bốn loại đất chính, đất Feralit phát triển trên đất bazan, đất Feralit phát triển trên đá và cát, đất Feralit phát triển trên phù sa cổ và đất phát triển trên đá sét. Khí hậu của vườn được xác định bởi nhiệt độ trung bình năm 25,4oC, lượng mưa 2185mm và độ ẩm 83,6%. Vườn có hai mùa rõ rệt, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 và mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10. Lượng mưa tập trung từ tháng 7 đến tháng 10, mỗi tháng mưa trên 300mm có ngày đạt đến 245mm. VQG có nhiều suối lớn đổ ra sông Đồng Nai. Thảm thực vât ở VQG gồm 5 kiểu rừng chính, bao gồm: rừng lá rộng thường xanh, rừng nửa rụng lá, rừng tre nứa, rừng hỗn giao tre nứa và thảm thực vật đầm lầy.

Rừng phòng hộ Tân Phú: Nghiên cứu tiến hành khảo sát tại khu rừng ở Tân Phú nằm ở vị trí 107o20’30” đến 107o27’30” kinh độ Đông và 11o02’32” đến 11o10’33” vĩ độ Bắc, với phía Bắc giáp xã Gia Canh và Công ty mía đường La Ngà, phía Nam giáp sông La Ngà (huyện Xuân Lộc), phía Đông giáp sông La Ngà (Tỉnh Bình Thuận) và phía Tây giáp Công ty mía đường La Ngà. Về mặt địa hình bao gồm đồi núi thấp, trung bình 70-150m, độ dốc không quá 10o. Lượng mưa hàng năm khoảng 2500-2800mm, tập trung chủ yếu vào mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10, nhiệt độ trung bình năm 27oC với độ ẩm 78%. Về thổ nhưỡng gồm 5 loại đất chính như đất bazan trên vùng đồi thấp, đất bazan trên đồi núi trung bình, đất phù sa cổ trên đồi thấp, đất phù sa cổ trên vùng bán bình nguyên và đất hình thành trên sa thạch, phiến thạch vùng đồi trung bình. Thảm thực vật đặc trưng bởi rừng nhiệt đới với các họ đặc trưng như họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) và họ Côm (Elaeocarpaceae). Rừng này thuộc rừng thứ sinh phục hồi sau khai thác được chọn vào những năm 1980 và 1990.

Khu rừng Vĩnh Cửu (Khu Bảo tồn thiên nhiên và Văn hóa Đồng Nai):

nằm trên địa bàn xã Phú Lý, Mã Đà, Phú Cường, Phú Ngọc, La Ngà và Ngọc Định (huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai). Xã Thanh Bình (Huyện Trảng Bom) xã Gia Tân (Thống Nhất). Đây là khu rừng đặc dụng có diện tích tự nhiên lớn nhất nước ta, với hệ sinh thái đặc trưng Đông Nam Bộ. Khu rừng này được thiết lập năm 2004 trực thuộc Ủy ban nhân dân tỉnh Đồng Nai. Khu vực này có 3 di tích lịch sử nổi tiếng là căn cứ Trung ương cục Đông Nam Bộ, căn cứ Khu ủy miền Đông Nam Bộ và địa đạo Suối Linh. Về thảm thực vật, khu rừng này gồm các kiểu rừng kín nửa rụng lá ẩm nhiệt đới, rừng kín rụng lá hơi ẩm nhiệt đới với các loài cây họ Dầu như Dầu nước (Dipterocarpus alatus), Dầu mít (Dipterocarpus costatus), Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri), Dầu lông (Dipterocarpus intricatus), Sao đen (Hopea odorata) và một số loài khác như họ Bồ hòn (Sapindaceae), họ Sim (Myrtaceae) và kiểu rừng kín thường xanh mưa nhiệt đới.

Bên cạnh loài cây họ Dầu còn có nhiều loài cây gỗ mọc hỗn giao đa số thuộc loài cây họ Đậu (Fabaceae) như Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa), Cẩm lai (Dalbergia oliveri), Giáng hương (Pterocarpus macrocarpus),... và các loài cây gỗ thuộc các họ khác như họ Xoài (Anacardiaceae), họ Dâu tằm (Moraceae), họ Bồ hòn (Sapindaceae), họ Tử vi (Lythraceae),... tạo thành rừng nhiều tầng tán, độ đa dạng thực vật khá cao, cây phụ sinh phong phú, độ tán che 0,7 và là kiểu rừng có cảnh sắc đa dạng phức tạp, tiêu biểu của kiểu rừng thường xanh ẩm nhiệt đới. Cấu trúc phức tạp nhiều tầng được phân biệt thành 5 tầng, trong đó có