Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một trong những kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp chất với mục đích xác định, định lượng và phân lập từng thành phân riêng lẻ của hợp
chất. Để xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm (dịch chiết) được phân tích HPLC trong điều kiện giống nhau.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5 mg/mL. Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2,0 mg/mL.
Điều kiện chạy HPLC
Loại thiết bị: Shimazu
Loại cột Cột: Atlantis C18, 5 µm, hãng Water
Chiều dài cột 4,6 x 250 mm.
Thời gian phân tích : 45 phút Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Bước sóng phân tích: 440 nm Thể tích mẫu bơm:
+ Mẫu chuẩn: 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl. + Dịch chiết: 10 μl.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B)
Thời gian (phút) Dung môi (MeOH:nước)
0,20 20:80 2,00 20:80 5,00 25:75 10,00 40:60 20,00 60:40 24,00 100:0 35,00 100:0 45,00 20:80 2.3.2. Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS)
Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích hiệu quả dựa trên khả năng phân tách các thành phần của hợp chất bằng sắc ký lỏng kết hợp
với độ đặc hiệu phát hiện của khối phổ. Sắc ký lỏng (LC) tách các thành phần mẫu và sau đó đưa chúng vào máy đo khối phổ (MS). Dữ liệu LC-MS có thể được sử dụng để cung cấp thông tin về khối lượng phân tử, cấu trúc, đặc điểm và hàm lượng của các thành phần mẫu cụ thể.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5mg/mL. Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2mg/mL.
Điều kiện chạy LC-MS
Máy LC-MS: Agilent
Cột sắc ký: Cột VertiSep GES C18 (150 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
Màng lọc 0,45 µm cho kim bơm mẫu dùng để lọc mẫu trước khi bơm vào hệ thống LC-MS.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B) biến đổi gradient từ tỉ lệ A:B từ 60:40 đến 0:100
Lượng mẫu bơm: 5 µl. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Thời gian phân tích: 25 phút Bước sóng phân tích: 440nm.
Hệ thống LC-MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ làm khô đạt 250ºC.
Phương pháp này được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ thuộc Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam
2.3.3. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành
Về nguyên tắc, các chất chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydro, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Phương pháp nghiên cứu này được thực hiện dựa trên mô tả của W.Brand-Williams và cộng sự [3] bằng cách
chuẩn bị dung dịch DPPH 0,2M trong ethanol (Merck) sau đó bổ sung 1,0 mL dung dịch này vào 1,0 mL dịch chiết dành dành trong nước cất ở nồng độ 0,005-1 g/L. Hỗn hợp được giữ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Sự giảm độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu. Các phép đo được thực hiện ba lần. Axit ascorbic được sử dụng làm chất chuẩn. Tỷ lệ ức chế (phần trăm) được tính theo phương trình sau:
Ức chế (%) = [1- (Ai - Aj) / A0] × 100
Trong đó, A0 là độ hấp thụ của mẫu trắng (DPPH), Ai là độ hấp thụ của mẫu có chứa DPPH và có nồng độ màu khác nhau. Aj là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (dịch chiết). Giá trị IC50 được tính toán bằng đồ thị.
2.3.4. Khảo sát tính an toàn của chế phẩm màu 2.3.4.1. Đánh giá độc tính trên chuột 2.3.4.1. Đánh giá độc tính trên chuột
18 con chuột nhắt trắng Swiss được chia làm 3 lô, 6 con/lô, trong đó có 1 lô đối chứng và 2 lô thử nghiệm. Các con chuột được bỏ đói 16 giờ trước khi cho uống 1 liều duy nhất dịch chiết dành dành. Mức liều của dịch chiết dành dành được sử dụng cho chuột là 2,062 mg/kg, 4,125 mg/kg, 8,250 mg/kg, 16,500 mg/kg và 33,000 mg/kg trọng lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước cất vô trùng).
Sau khi cho chuột uống dịch chiết dành dành từ 1 đến 2 giờ, cho chuột ăn uống như bình thường và tiếp tục theo dõi trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong mỗi lô thử nghiệm, từ đó tính toán giá trị LD50.
2.3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn
Dịch chiết của dành dành được pha với nước từ bột màu dành dành theo dải nồng độ: 0,1 g/L, 0,5g/L, 1g/L, 2g/L, 4g/L, 8g/L, 12 g/L để thử nghiệm độc tính với phôi cá ngựa vằn.
Quy trình thử độc trên phôi cá ngựa vằn dựa theo hướng dẫn của OECD về thử độc trên đối tượng phôi cá (OECD 236). Phôi cá ngựa vằn sau khi chọn lọc sẽ được chuyển vào đĩa 24 giếng có chứa hóa chất với mật độ 1 phôi/giếng. Mỗi giếng
thử nghiệm sẽ được thay mới hóa chất, quan sát, ghi lại tỷ lệ sống chết và các hình thái phôi phát triển bất thường sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ. Thử nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.
2.3.5. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm 2.3.5.1. Độ hòa tan 2.3.5.1. Độ hòa tan
Bột dành dành khô được hòa tan với nước ở các nồng độ 0,1 g/L, 0,4 g/L và 0,8 g/L để tạo thành dung dịch đồng nhất. Quan sát mức độ đồng nhất của dung dịch trong điều kiện ánh sáng thường.
2.3.5.2. Khả năng chịu pH
Chuẩn bị dịch chiết dành dành trong nước với nồng độ 0,4 g/L. NaOH 0,5N và HCl 0,5N được sử dụng để thay đổi pH của dung dịch mẫu từ 1,0 đến 12,0. Sau đó, sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440nm.
2.3.5.3. Khả năng chịu nhiệt
Độ bền nhiệt của màu vàng được xác định ở các nhiệt độ khác nhau từ 40- 100°C. Ở mỗi nhiệt độ, mẫu được giữ trong nồi cách thủy trong 5 phút. Sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.5.4. Độ bền màu trong thời gian bảo quản
Bột màu dành dành được bảo quản ở 4°C trong 12 tháng và độ hấp thụ được xác định tại tháng 0; 6 và 12 bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.6. Xử lý số liệu
Phần mềm Graphpad Prism 6.0 được dùng để phân tích hồi quy và xây dựng biểu đồ đường cong đáp ứng liều trong thử nghiệm độc tính trên phôi cá ngựa vằn.
Phần mềm Excel 2010 được sử dụng để xác định đường tuyến tính và xử lý các số liệu, tính toán các giá trị IC50, LD50.
Mối liên hệ giữa thể tích mẫu và hàm lượng được tính toán dựa trên công thức sau đây:
𝐶 =𝑚 𝑉
Trong đó, C là nồng độ của mẫu (μg/ul), m là hàm lượng chất tan trong mẫu tính (μg) và V là thể tích của mẫu (μl).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành 3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết
Hạt dành dành khô được chiết với nước theo các tỉ lệ từ 1:2,5 đến 1:20 (trọng lượng: thể tích) ở 100ºC trong 5 phút. Sau đó, dịch chiết được lọc qua lưới (kích thước mắt 20 - 40 µm) để loại bỏ cặn và sấy khô để thu được dạng bột màu vàng. Khối lượng bột màu dành dành được ghi lại và so sánh với khối lượng hạt dành dành nguyên liệu. Kết quả được thể hiện ở hình 6 dưới đây.
Hình 6: Hiệu suất của quá trình chiết hạt dành dành
Kết quả cho thấy, tỉ lệ nguyên liệu - dung môi là 1:10 là tỉ lệ tối ưu nhất, khi đó 30,0g hạt dành dành khô sau quá trình tách chiết thu được 7,42g bột khô, tương đương với hiệu suất thu hồi là 24,74%.
3.1.2. Phân tích thành phần hoá học của dịch chiết bằng HPLC
Bột màu vàng từ dịch chiết hạt dành dành được hoà tan trong mung môi methanol 80% và phân tích thành phần bằng hệ thống HPLC. Các điều kiện khác nhau của HPLC bao gồm: loại cột sắc ký chạy HPLC (C18 của hãng Phenomenex hoặc C18 của hãng Water), dung môi chạy (acetonitril hoặc methanol trong nước), thời gian phân tích mẫu từ 18 - 45 phút đã được thử nghiệm nhằm tìm ra điều kiện chạy HPLC tối ưu. Kết quả cho thấy, sự phân tách các đỉnh trên sắc ký đồ HPLC tốt nhất khi sử dụng cột phân tích HPLC C18 của hãng Water, pha động là gradient của
16.92 22.56 24.74 23.17 22.79 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 1:2,5 1:5 1:10 1:15 1:20 % hiệu suấ t
methanol trong nước với thời gian phân tích là 45 phút (hình 7), các hợp chất trong mẫu được phát hiện ở 3 bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm.
Kết quả phân tích dịch chiết từ hạt dành dành cho thấy, ở bước sóng 440 nm có 5 đỉnh xuất hiện với các thời gian lưu là 26,2; 26,7; 28,2; 28,9 và 30,2 phút. Các đỉnh này hấp thụ mạnh ở bước sóng 440 nm hơn là hấp thụ các bước sóng ngắn 212 nm và 254 nm. Phổ hấp thụ UV-Vis của 5 đỉnh này khi quét ở dải bước sóng 200 - 800 nm cũng xác định các hợp chất tương ứng với 5 đỉnh này có cực đại hấp thụ xấp xỉ 440 nm (hình 8). Phổ UV-Vis của 5 hợp chất trùng với phổ hấp thụ của các hợp chất crocin vì vậy chúng tôi nhận định ban đầu là có sự xuất nhiện của nhiều chất crocin trong dịch chiết từ hạt dành dành.
Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm
(cột C18, gradient dung môi là 20% -100% methanol trong nước, thời gian phân tích 45 phút) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min -50 -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 mAU 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 % B.Conc.(Method) Ch4-440nm,4nm (1.00) Ch2-254nm,4nm (1.00) Ch1-212nm,4nm (1.00)
Hình 8: Phổ hấp thụ của dịch chiết dành dành ở bước sóng từ 200-800 nm Bên cạnh dịch chiết từ quả dành dành mẫu crocin chuẩn được cung cấp bởi hãng Sigma cũng được phân tích ở cùng điều kiện HPLC để làm mẫu tham chiếu. Kết quả cho thấy, ở cùng bước sóng hấp thụ 440 nm, sắc ký đồ của chất chuẩn crocin cũng xuất hiện 5 đỉnh ở các phút thứ 26,2; 26,7; 28,2; 28,9 và 30,2 phút. Trong số 5 đỉnh xuất hiện thì đỉnh lớn nhất xuất hiện ở phút thứ 26,2 tương tự như ở mẫu dịch chiết. Như vậy, có thể thấy rằng trong dịch chiết có chứa các thành phần crocin tương tự như trong mẫu crocin chuẩn. Tuy nhiên, để xác định chính xác loại crocin trong cả mẫu chất chuẩn và mẫu dịch chiết cần phải tiến hành các nghiên cứu khác chẳng hạn như LC-MS nhằm xác định khối lượng phân tử của hợp chất.
Hình 9: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn crocin ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min -50 -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 mAU Ch4-440nm,4nm (1.00) Ch2-254nm,4nm (1.00) Ch1-212nm,4nm (1.00)
Bên cạnh việc quan sát ở bước sóng 440 nm, các thành phần hợp chất khác ngoài crocin được phát hiện ở bước sóng thấp hơn là 212 nm và 254 nm. Kết quả thể hiện trên sắc ký đồ hình 7 và 9 cũng cho thấy mẫu chuẩn chỉ chứa các hợp chất crocin trong khi mẫu dịch chiết còn có lẫn nhiều chất khác, trong đó có các hợp chất hấp thụ bước sóng 254 nm với thời gian lưu là 15,5; 17,6 và 24,2 phút; hợp chất hấp thụ bước sóng 212 nm ở thời gian lưu là 2,6 phút. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp về độ tinh sạch của crocin trong mẫu dịch chiết, vì đây là dịch chiết thô chưa được tinh sạch qua cột. Tuy nhiên kết quả phân tích bằng HPLC trên cũng khẳng định bằng cách sử dụng nước làm dung môi tách chiết chúng tôi đã thu được nhiều loại crocin tương tự như chất chuẩn thương mại.
3.1.3. Xác định thành phần crocin bằng LC-MS
Thành phần crocin trong mẫu chuẩn (mẫu tham chiếu) và trong dịch chiết dành dành (mẫu thử nghiệm) được xác định bằng phương pháp đo phổ khối lượng (LC-MS) ở chu kỳ 25 phút. Kết quả được minh hoạ ở hình 10 cho thấy: thành phần crocin trong mẫu thí nghiệm hoàn toàn giống mẫu tham chiếu với 5 đỉnh ở các thời gian lưu thời gian lưu 12,2; 12,7; 13,3; 16,2 và 17,1 phút. Phổ hấp thụ UV – Vis cho thấy các chất xuất hiện ở 5 thời gian lưu này hoàn toàn giống nhau ở cả mẫu thí nghiệm và mẫu tham chiếu (hình 11), đây cũng là phổ hấp phụ UV-Vis đặc trưng của các chất thuộc nhóm crocin đã được công bố bởi Hadizadeh và cộng sự [11]. Tuy nhiên, tương quan về độ lớn của các đỉnh có sự khác nhau ở mẫu tham chiếu và mẫu thí nghiệm chứng tỏ tỷ lệ về hàm lượng của mỗi loại crocin trong hai mẫu này khác nhau.
Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại bước sóng 440 nm
Hình 11: Phổ UV của crocin trong mẫu tham chiếu và mẫu thử nghiệm Phổ khối của các chất tương ứng với 5 đỉnh trên sắc ký đồ trích xuất từ phần mềm của hệ thống LC-MS. Kết quả cho thấy 4 trong 5 đỉnh trên xuất hiện số khối, riêng đỉnh P5 không xuất hiện số khối ở cả hai mẫu. Kết quả số khối của các chất được trình bày ở bảng 5 và được minh hoạ trong hình 12 và hình 13.
Bảng 5: Số khối của các hợp chất tương ứng với các đỉnh P1-P4
Đỉnh
Số khối ở trạng thái ion dương [M+Na]+
(m/z) Số khối ở trạng thái ion âm [M+Cl]- (m/z) Khối lượng phân tử (Dalton) P1 999 1011 [M+Cl]- 976 P2 999 1011 [M+Cl]- 976 P3 837 849 [M+Cl]- 814 P4 999 1011 [M+Cl]- 976
Dựa vào phổ khối ESI ở bảng 5 cho thấy ở cả hai mẫu dịch chiết và mẫu tham chiếu đều chứa 3 chất tương ứng với các đỉnh P1, P2 và P4 đều có khối lượng phân tử 976 Dalton. Chứng tỏ, cả 3 chất này đều là crocin-1 hay còn gọi là α-crocin như đã được khẳng định trong công bố của Srivastava và cộng sự [28]. Sở dĩ hợp chất crocin-1 có xuất hiện nhiều đỉnh trên sắc ký đồ là do hợp chất này tồn tại ở các dạng đồng phân khác nhau, mỗi loại đồng phân lại có độ phân cực khác nhau. Do vậy, trong quá trình phân tách qua cột sắc ký các đồng phân này xuất hiện ở các thời gian lưu khác nhau. Chất tương ứng với đỉnh P3 có trọng lượng phân tử 814 Dalton, chứng tỏ đây là hợp chất crocin-2. Loại crocin này cũng đã được công bố bởi tác giả Srivastava và cộng sự [28] với trọng lượng phân tử là 814 Dalton.
Hình 12: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh chính (P1) trong dịch chiết
Hình 13 : Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết [M + Cl]-
Như vậy, trong mẫu dịch chiết và mẫu crocin tham chiếu đều có chứa 2 thành phần crocin là crocin-1 và crocin-2. Hàm lượng của hai loại crocin này trong dịch chiết và trong mẫu chuẩn được xác định bởi tương quan diện tích của các đỉnh tương ứng nhờ phương pháp HPLC phân tích trong thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4. Xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành