Thành phần crocin trong mẫu chuẩn (mẫu tham chiếu) và trong dịch chiết dành dành (mẫu thử nghiệm) được xác định bằng phương pháp đo phổ khối lượng (LC-MS) ở chu kỳ 25 phút. Kết quả được minh hoạ ở hình 10 cho thấy: thành phần crocin trong mẫu thí nghiệm hoàn toàn giống mẫu tham chiếu với 5 đỉnh ở các thời gian lưu thời gian lưu 12,2; 12,7; 13,3; 16,2 và 17,1 phút. Phổ hấp thụ UV – Vis cho thấy các chất xuất hiện ở 5 thời gian lưu này hoàn toàn giống nhau ở cả mẫu thí nghiệm và mẫu tham chiếu (hình 11), đây cũng là phổ hấp phụ UV-Vis đặc trưng của các chất thuộc nhóm crocin đã được công bố bởi Hadizadeh và cộng sự [11]. Tuy nhiên, tương quan về độ lớn của các đỉnh có sự khác nhau ở mẫu tham chiếu và mẫu thí nghiệm chứng tỏ tỷ lệ về hàm lượng của mỗi loại crocin trong hai mẫu này khác nhau.
Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại bước sóng 440 nm
Hình 11: Phổ UV của crocin trong mẫu tham chiếu và mẫu thử nghiệm Phổ khối của các chất tương ứng với 5 đỉnh trên sắc ký đồ trích xuất từ phần mềm của hệ thống LC-MS. Kết quả cho thấy 4 trong 5 đỉnh trên xuất hiện số khối, riêng đỉnh P5 không xuất hiện số khối ở cả hai mẫu. Kết quả số khối của các chất được trình bày ở bảng 5 và được minh hoạ trong hình 12 và hình 13.
Bảng 5: Số khối của các hợp chất tương ứng với các đỉnh P1-P4
Đỉnh
Số khối ở trạng thái ion dương [M+Na]+
(m/z) Số khối ở trạng thái ion âm [M+Cl]- (m/z) Khối lượng phân tử (Dalton) P1 999 1011 [M+Cl]- 976 P2 999 1011 [M+Cl]- 976 P3 837 849 [M+Cl]- 814 P4 999 1011 [M+Cl]- 976
Dựa vào phổ khối ESI ở bảng 5 cho thấy ở cả hai mẫu dịch chiết và mẫu tham chiếu đều chứa 3 chất tương ứng với các đỉnh P1, P2 và P4 đều có khối lượng phân tử 976 Dalton. Chứng tỏ, cả 3 chất này đều là crocin-1 hay còn gọi là α-crocin như đã được khẳng định trong công bố của Srivastava và cộng sự [28]. Sở dĩ hợp chất crocin-1 có xuất hiện nhiều đỉnh trên sắc ký đồ là do hợp chất này tồn tại ở các dạng đồng phân khác nhau, mỗi loại đồng phân lại có độ phân cực khác nhau. Do vậy, trong quá trình phân tách qua cột sắc ký các đồng phân này xuất hiện ở các thời gian lưu khác nhau. Chất tương ứng với đỉnh P3 có trọng lượng phân tử 814 Dalton, chứng tỏ đây là hợp chất crocin-2. Loại crocin này cũng đã được công bố bởi tác giả Srivastava và cộng sự [28] với trọng lượng phân tử là 814 Dalton.
Hình 12: Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh chính (P1) trong dịch chiết
Hình 13 : Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết [M + Cl]-
Như vậy, trong mẫu dịch chiết và mẫu crocin tham chiếu đều có chứa 2 thành phần crocin là crocin-1 và crocin-2. Hàm lượng của hai loại crocin này trong dịch chiết và trong mẫu chuẩn được xác định bởi tương quan diện tích của các đỉnh tương ứng nhờ phương pháp HPLC phân tích trong thí nghiệm tiếp theo.