Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.1.Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin
- Xác định hiệu giá virus của lô vacxin ( liều gây nhiễm 50% phôi; EID50) - Kiểm tra chỉ tiêu vơ trùng
- Kiểm tra chỉ tiêu an tồn - Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực.
3.1.2. Đánh giá độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin
- Công cường độc trên động vật thí nghiệm ở các thời điểm nhất định
sau tiêm.
3.1.3. Kiểm tra độ dài bảo quản của vacxin sau thời gian lƣu kho ở nhiệt độ 2o-8oC.
3.1.4. Ứng dụng vacxin trong phòng bệnh và can thiệp dịch. 3.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Vacxin nhược độc đông khô.
3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam.
- Kết quả ứng dụng vacxin trong phòng được tiến hành trên một số xã tại địa bàn vùng phụ cận Hà Nội (Văn Giang-Hưng Yên).
3.4. NGUYÊN LIỆU
- Các loại môi trường: thạch máu, thạch nấm, nước thịt và nước thịt gan yếm khí.
- Mẫu vacxin ở dạng đông khô
- Chủng virus cường độc Newcastle velogenic (VN91)
- Phôi gà sạch SPF: 9-11 ngày tuổi, được nhập từ hãng VALO, BioMedia-Đức.
- Gà ni thí nghiệm từ 1-7 ngày tuổi, sinh ra từ đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng vacxin Newcastle.
- Dụng cụ và hố chất phịng thí nghiệm.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu theo TCVN 8684:2011 Vacxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm
Mẫu kiểm nghiệm là các đơn vị sản phẩm được lấy ra từ các lô vacxin để tiến hành kiểm nghiệm trước khi xuất sử dụng và lưu giữ trong thời hạn bảo quản của vacxin để giải quyết các tranh chấp nếu có.
- Mẫu được lấy theo lơ vacxin. Lơ vacxin là toàn bộ các sản phẩm được chia vào vật chứa cuối cùng, từ cùng một khối lượng vacxin đồng nhất, trong cùng một ca sản xuất.
- Mẫu lấy theo phương pháp ngẫu nhiên theo tỷ lệ sau: + 10% sản phẩm (ít nhất là 5) đối với lô dưới 100 sản phẩm + 10% sản phẩm đối với lô từ 100 đến 500 sản phẩm
+ 2% sản phẩm đối với lô từ 500 sản phẩm trở lên (nhiều nhất là 20 sản phẩm).
3.5.2. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (liều gây nhiễm 50% phôi - EID50) của lô vacxin
- Chuẩn bị trứng sạch: trứng gà có phơi 9-11 ngày tuổi, soi trứng, chọn những phôi khoẻ mạnh, đánh dấu buồng hơi, đánh dấu vị trí đầu phơi, sát trùng bằng cồn 70o
xung quanh vỏ trứng, sát trùng vị trí buồng hơi, vị ví tiêm ở đầu phôi bằng cồn iod 5%.
- Lấy mẫu theo TCVN 8684:2011 Vacxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm (như phần 3.5.1).
Tiến hành
Hiệu giá virus Newcastle chủng Entero clone được chuẩn độ trên trứng gà SPF có phơi 9-11 ngày tuổi. Để chuẩn độ hiệu giá virus cần 50 trứng SPF, chia làm 10 nồng độ, mỗi nồng độ 5 quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trứng gà có phơi được lau sạch, ấp ở nhiệt độ 37 ± 0,50C; soi loại những quả bị chết phơi, đánh dấu vị trí buồng hơi và đầu phơi.
Virus dạng đơng khơ, được pha lỗng bằng nước muối sinh lý hoặc PBS vô trùng thành 10 nồng độ, từ 10-1 đến 10-10
Gây nhiễm virus vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,1 ml huyễn dịch virus đã pha lỗng. Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi. Những phôi chết trước 24 giờ sau khi gây nhiễm được loại bỏ. Những quả chết phôi sau 24 giờ gây nhiễm được bảo quản tủ lạnh dương (2-80C) chờ thu hoạch.
Thu hoạch nước niệu nang, chuẩn độ hiệu giá bằng phản ứng HA, phơi có hiệu giá HA trên 4log2 được công nhận là nhiễm.
Ghi số phơi có bệnh tích, khơng có bệnh tích (so sánh với phôi đối chứng) ở mỗi nồng độ pha lỗng virus.
Tính tốn liều gây nhiễm tối thiểu 50% phơi (EID50) theo cơng thức của Reed-Muench.
Tính tỷ lệ phơi nhiễm ở các nồng độ theo cơng thức:
Tính ELD50 theo công thức của Reed Muench: Lg ELD50 = lgA + X lgf
X =
A'-50 A'-B' Trong đó:
X: khoảng cách cân đối
A: độ pha lỗng virus gây chết cận trên A′: Tỷ lệ % phôi chết cận trên 50% B′: Tỷ lệ % phôi chết cận dưới 50% f: bậc pha loãng của virus
3.5.3. Phƣơng pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
3.5.3.1. Áp dụng theo TCVN 8684:2011 Vacxin thú y – Quy trình kiểm tra thuần khiết
Mẫu lơ vacxin được lấy theo tiêu chuẩn ngành, sau đó mẫu được hoàn nguyên trở lại bằng nước muối sinh lý vô trùng 0,85%.
Tỷ lệ phôi nhiễm (%) = Tổng số phôi nhiễm
Tổng số phôi nhiễm + tổng số phôi không nhiễm
Bước 1: Mỗi mẫu vacxin trong lô được kiểm tra trên các môi trường với số lượng như sau:
- 4 ống (hoặc bình 50ml) nước thịt dinh dưỡng - 4 ống ( hoặc đĩa ) thạch máu
- 4 ống mơi trường yếm khí - 4 ống môi trường nấm
Bước 2: các mơi trường trên được chế theo các quy trình thơng dụng hoặc từ môi trường chế sẵn, để phát hiện được các vi khuẩn dung huyết, hiếu khí, yếm khí và nấm có trong vacxin.
Bước 3: lượng vacxin cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích mơi trường Bước 4: môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 37o
C. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phịng (25-30oC).
Đọc kết quả:
Lơ vacxin được xem là đạt vơ trùng khi khơng có bất cứ loại vi sinh vật
tạp nào mọc trên các môi trường trong thời gian theo dõi.
3.5.4. Phƣơng pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
An toàn là một trong những chỉ tiêu quan trọng của một loại vacxin. Bất cứ loại vacxin nào sau khi sản xuất đều phải kiểm tra chỉ tiêu này.
Để đánh giá độ an toàn của vacxin thành phẩm sử dụng gà khỏe mạnh từ 1-7 ngày tuổi, mẫn cảm chia làm 2 nhóm:
- Nhóm A: 10 gà , mỗi con được uống 10 liều vacxin sử dụng. - Nhóm B: 10 gà đối chứng, khơng dùng vacxin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yêu cầu: Lô vắc xin được coi là an toàn khi tất cả gà sống khỏe, khơng có phản ứng bất thường trong thời gian 14 ngày theo dõi.
3.5.5. Phƣơng pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực
Kiểm tra hiệu lực của vacxin là yêu cầu cần thiết đối với mỗi lô vacxin. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp công cường độc để kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin.
Dùng gà từ 1-7 ngày tuổi, khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm phòng vacxin Newcastle . Chia gà thành 2 lô:
- Lô đối chứng: không dùng vacxin
Sau 14 ngày, cơng cường độc cho cả gà thí nghiệm và gà đối chứng liều 100LD50 virus cường độc Newcastle Velogenic (VN91) bằng cách nhỏ mũi. Theo dõi gà 14 ngày sau khi công. Hiệu lực của vacxin được đánh giá thông qua tỷ lệ bảo hộ của đàn gà. Tính tỷ lệ bảo hộ theo cơng thức:
3.5.6. Phƣơng pháp đánh giá độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin * Kiểm tra độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin nhược độc ND-
Clone Entero bằng cách:
Dùng gà khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm phịng vacxin ND-Clone Entero.
- Cách làm: thí nghiệm được tiến hành với 2 lơ vacxin *Chia gà thành 2 lơ:
- Lơ thí nghiệm: Nhỏ cho gà 1 liều vacxin sử dụng (106EID50) . - Lô đối chứng: không dùng vacxin
Định kỳ kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin đối với gà sau khi dùng ở các thời điểm 7 ngày, 14 ngày, 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng và 13 tháng bằng phương pháp công cường độc cho cả gà thí nghiệm và đối chứng liều 100 LD50 virus cường độc Newcastle velogenic (VN 91) bằng cách nhỏ mũi. Theo dõi gà 14 ngày sau khi công. Xác định số gà sống và số gà chết ở các thời gian cơng.
Tính tỷ lệ bảo hộ theo công thức:
3.5.7. Phƣơng pháp kiểm tra độ dài bảo quản của vacxin nhƣợc độc ND- Clone Entero sau thời gian lƣu kho
Sau khi lấy mẫu, vacxin được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ 2 - 8oC. Tiến hành kiểm tra hiệu lực vacxin sau khi lưu kho ở các thời điểm: 3, 6, 9, 12, Tỷ lệ bảo hộ (%) = Tổng số gà sống Tổng số gà sống + tổng số gà chết x 100 Tỷ lệ bảo hộ (%) = Tổng số gà sống Tổng số gà sống + tổng số gà chết x 100
18, 24 và 25 tháng. Mẫu được lấy ở các thời điểm này đem nhỏ cho gà thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần.
Dùng gà 1-7 ngày tuổi, khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa phòng vacxin Newcastle. Chia gà thành 2 lơ:
- Lơ thí nghiệm: nhỏ cho gà 1 liều vacxin sử dụng (106
EID50) - Lô đối chứng: không dùng vacxin
Sau 14 ngày, cơng cường độc cho cả gà thí nghiệm và đối chứng liều 100 LD50 virus cường độc Newcastle velogenic bằng cách nhỏ mũi hoặc cho uống. Theo dõi gà 14 ngày sau khi công. Vacxin đạt hiệu lực khi 100% số gà thí nghiệm được bảo hộ, gà đối chứng chết hết.
3.5.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU KỸ THUẬT CỦA VACXIN
Để có vacxin phịng bệnh cho đàn gà góp phần vào cơng tác phịng chống dịch bệnh trên, gia cầm. Hàng năm, Công ty TNHH MTV Avac đã sản xuất hàng trăm triệu liều vacxin nhược độc ND-Clone Entero đơng khơ. Quy trình sản xuất vacxin trên phôi gà SPF từ virus Newcastle nhược độc chủng Clone Entero được thực hiên qua các bước sau:
1. Kiểm định và bảo quản giống - Giống gốc
- Giống sản xuất 2. Chuẩn bị trứng SPF
3. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất 4.Cấy virus sản xuất vacxin
5.Thu hoạch, xử lý và bảo quản vacxin bán thành phẩm 6.Sản xuất vacxin thành phẩm
Ở mỗi khâu sản xuất đều yêu cầu kỹ thuật chặt chẽ từ nguyên liệu môi trường, thao tác kỹ thuật,...Chỉ cần một khâu bị sai sót là có thể làm ảnh hưởng đến tồn bộ quả trình sản xuất vacxin gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Vì vậy, chúng tơi hết sức chú trọng trong q trình này.
Bên cạnh đó, theo quy định, bất cứ loại vacxin nào trước khi xuất xưởng bắt buộc phải kiểm tra đủ 3 chỉ tiêu: vơ trùng, an tồn và hiệu lực. Đây là những chỉ tiêu chính và cũng là những chỉ tiêu quan trọng không thể thiếu trong quá trình kiểm nghiệm đối với mỗi loại vacxin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ấp tiếp ở 370 C/96 giờ Thu trứng, để lạnh 40 C/12 giờ
Giống gốc
Pha với nước sinh lý thành nồng độ 10-2
Giống sản xuất Kiểm tra vô trùng
Gây nhiễm phôi trứng
Mổ trứng
Thu chất chứa virus
Bán thành phẩm Kiểm tra vô trùng
Chuẩn độ hiệu giá
Kiểm nghiệm
n
Ra chai -> đông khô, dán nhãn, bảo quản
Sơ đồ 4.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhƣợc độc Newcastle chủng Clone Entero
4.1.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá virus (liều gây nhiễm 50% phôi- EID50) của 3 lô vacxin nhƣợc độc ND-Clone Entero đông khô. 3 lô vacxin nhƣợc độc ND-Clone Entero đông khô.
Áp dụng theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011, mỗi lô vacxin lấy ngẫu nhiên 20 mẫu.
Song song với q trình kiểm tra vơ trùng của lô vacxin, chúng tôi tiến hành lấy 3 mẫu để kiểm tra hiệu giá virus trên 1 liều sử dụng của mỗi lô vacxin. Cách tiến hành như sau:
- Pha loãng 1 liều virus vacxin theo cơ số 10, nồng độ từ 10-1 đến 10-10
. Mỗi nồng độ pha lỗng tiêm vào xoang niệu mơ 5 phôi với liều 0,1ml/phôi. Sau 96 giờ theo dõi, ghi số phơi sống, số phơi chết. Tính EID50 theo cơng thức Reed Muench. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Kết quả thể hiện trong bảng 4.1 cho thấy: cả 3 mẫu thí nghiệm, mỗi liều vacxin đều cho hiệu giá virus từ 106.5đến 107.4
EID50/0,1ml. Theo tiêu chuẩn
nhà sản xuất đưa ra thì lơ vacxin phải đạt hiệu giá virus ít nhất là 106 EID50/1 liều vacxin.
Như vậy, sau khi kiểm tra hiệu giá virus của lô vacxin thứ nhất, chúng tôi thấy: cả 3 mẫu vacxin của lô 1 đều phù hợp với tiêu chuẩn đề ra.
Bảng 4.1. Kết quả xác định hiệu giá virus vacxin nhƣợc độc Newscatle chủng Clone Entero (3 mẫu vacxin lô 1)
Mẫu số Độ pha loãng Số trứng tiêm/ nồng độ Liều tiêm (ml) Kết quả EID50/ liều
Yêu cầu vacxin
01 10-1- 10-10 5 0,1 106.5 ≥106 EID50/liều
02 10-1- 10-10 5 0,1 106.6 ≥106 EID50/liều
03 10-1- 10-10 5 0,1 107.4 ≥106
EID50/liều (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với lô vacxin thứ 2 và thứ 3, chúng tôi cũng làm tương tự như lô vacxin thứ nhất. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xác định hiệu giá virus vacxin ND-Clone Entero của 3 lô vacxin
Lô vacxin ∑ số mẫu kiểm tra Số lần thí nghiệm/lơ EID50trung bình/lơ EID50trung bình/3lơ 1 3 3 106.8 106.53/liều 2 3 3 106.5 3 3 3 106.3
Qua bảng 4.2 cho thấy:
+ Lô vacxin 1: với 3 lần thí nghiệm ở 3 mẫu kiểm tra cho chỉ số EID50 trung bình là 106.8
+ Lơ vacxin 2: cho chỉ số EID50trung bình là 106.5 + Lơ vacxin 3: cho chỉ số EID50trung bình là 106.3
Từ đó thấy cả 3 lơ vacxin được kiểm tra hiệu giá virus đều cho kết quả đạt yêu cầu đề ra.
4.1.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin
4.1.2.1. Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng trên các môi trường thông thường
Để kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhược độc ND-Clone Entero chế trên phôi gà sạch SPF, mỗi lô vacxin chúng tôi lấy mẫu theo 10TCN 160-92. Mẫu lơ vacxin được hồn ngun trở lại bằng nước muối sinh lý vô trùng 0,85%, sau đó ni cấy trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí và mơi trường ni cấy nấm: thạch nấm. Hút 0,2 ml vacxin cấy vào một ống môi trường, mỗi loại mơi trường dùng 4 ống, sau đó để vào tủ ấm 370C/7 ngày, đem kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn, riêng môi trường thạch nấm sau khi cấy vacxin để ở nhiệt độ phòng 7 ngày (bảng 4.3).
Kết quả bảng 4.3 cho thấy: cả 3 mẫu kiểm tra/lô vacxin, 12/12 ống môi trường nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm đều cho kết quả đạt tiêu chuẩn vô trùng.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhƣợc độc ND- Clone Entero Môi trƣờng kiểm Số tra mẫu kiểm tra/lô
Nƣớc thịt Thạch máu Nƣớc thịt gan yếm khí Thạch nấm
Đánh giá (đạt tiêu chuẩn VT) Số ống kiểm tra/ mẫu Thời gian theo dõi (ngày) Kết quả âm tính/ số ống KT Số ống kiểm tra/ mẫu Thời gian theo dõi (ngày) Kết quả âm tính/ số ống KT Số ống kiểm tra/ mẫu Thời gian theo dõi (ngày) Kết quả âm tính/ số ống KT Số ống kiểm tra/ mẫu Thời gian theo dõi (ngày) Kết quả âm tính/ số ống KT Lô 1 (3) 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 Đạt Lô 2 (3) 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 Đạt Lô 3 (3) 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 4 7 12/12 Đạt
4.1.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin
Chỉ tiêu an toàn là một trong những chỉ tiêu bắt buộc khi đánh giá chất lượng của bất kỳ vacxin nào. Một vacxin được đánh giá là an toàn khi dùng cho bản động vật trong phịng thí nghiệm liều vacxin gấp nhiều lần liều sử dụng, động vật khơng bị chết hoặc khơng có bất cứ triệu chứng lâm sàng nào có thể quan sát được. Để kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin nhược độc ND-Clone Entero, chúng tôi tiến hành đối với gà nuôi ở phịng thí nghiệm (từ 1-7 ngày tuổi), đồng thời kiểm tra trên một số đàn gà nuôi tại địa phương.
Với đàn gà ni tại phịng thí nghiệm, mỗi mẫu vacxin thí nghiệm chúng tơi