PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm:
Tiến hành nghiên cứu trên 20 vịt con 1 ngày tuổi, giống vịt trời, chia làm hai lô: lô thí nghiệm 10 con nuôi ở khu nuôi động vật thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp 2 của khoa Thú y.
Lô đối chứng 10 con nuôi ở khu nuôi đối chứng.
Thí nghiệm: Địa điểm thí nghiệm tại khu nuôi động vật thí nghiệm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Khu nuôi động vật thí nghiệm được vệ sinh sạch sẽ, thường xuyên phun thuốc sát trùng. Các dụng cụ sử dụng luôn đúng quy định vô trùng không để lây nhiễm mầm bệnh từ bên ngoài vào và từ phòng thí nghiệm sang phòng đối chứng (sử dụng các dụng cụ trong phòng đối chứng và phòng gây nhiễm luôn phải riêng biệt, khi đi từ bên ngoài vào trong phòng thí nghiệm luôn luôn phải mặc áo blue và đi ủng, đeo khẩu trang, sát trùng trước khi vào phòng thí nghiệm...).
Trước khi gây nhiễm vịt trời được nuôi vịt 14 ngày để theo dõi tình hình sức khỏe. Tiến hành theo dõi nhiệt độ, kiểm tra các trạng thái lâm sàng ở trạng thái sinh lý bình thường như thế nào để đối chứng với khi gây nhiễm bệnh, và đồng thời cho vịt thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm, khẳng định vịt thí nghiệm chưa từng tiếp xúc với virus dịch tả vịt.
Sau đó vịt được gây nhiễm bằng chủng virus VG-04, liều 106
TCID50/ml/con, gây nhiễm bằng phương pháp sử dụng giống virus cường độc dịch tả vịt pha loãng với nước sinh lý rồi tiêm dưới da cho 10 vịt thí nghiệm mỗi con 0,5ml.
Vịt đối chứng được tiêm mỗi con 0,5 ml nước sinh lý. Sau khi gây nhiễm, theo dõi chặt chẽ vịt trạng thái lâm sàng của vịt thí nghiệm. Lấy phân và dịch swab vào tất cả các ngày sau khi gây nhiễm để kiểm tra sự đào thải virus Lấy máu vào ngày thứ 2, và 3 sau khi gây nhiễm để xét nghiệm. Theo dõi cho tới khi vịt con chết thì đem mổ khám.
Phương pháp theo dõi và xác định bệnh:
- Phương pháp quan sát và khám lâm sàng bằng kiểm tra trực tiếp
Theo dõi và ghi chép các thông tin từ khi vịt xuất hiện những triệu chứng lâm sàng đầu tiên đến khi vịt chết.
Nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học:
Chúng tôi tiến hành lấy máu ở tim của vịt mắc DEV vào 8 giờ sáng hàng ngày. Máu lấy xong đưa nhanh vào ống EDTA, lắc nhẹ, bảo quản trong bình lạnh từ 2 - 80C.
Các chỉ tiêu huyết học được đo trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu và được chạy bằng máy Cell - Dyn 3700 (hãng Abbort-Hoa kỳ) tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân. Đếm trên toàn bộ ống mẫu máu xét nghiệm mà không cần tách hay pha loãng mẫu.
- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/µl), (1mm3 = 1µl)
Hàm lượng huyết sắc tố (HGB, g/l). Tỷ khối huyết cầu (HCT, %)
Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl)
Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg)
Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/µl) và công thức bạch cầu (%)
Phương pháp mổ khám:
Mổ khám theo Nguyễn Hữu Nam và cs.(2015)
Vịt bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ tất cả các khí quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể và lấy mẫu: Gan, lách, thận,… sau đó tiến hành ngâm bảo quản ở formol 10% để làm tiêu bản vi thể.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể:
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm đúc parafin theo Robert (1969), Burn (1974), cắt dán mảnh bằng máy cắt chuyên dụng, nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE).
Mỗi vịt bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan một miếng bệnh phẩm rồi đúc thành block. Mỗi block được tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản, soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có 2 tiêu bản có bệnh tích trở lên thì chúng tôi coi là dương tính.
Quy trình làm tiêu bản: Các bước tiến hành
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 - 52ºC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin - Eosin,…
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là gan, thận, lách,… - Cố định bệnh phẩm (mục đích để giết chết tổ chức).
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm: Mục đích tạo ra các chất nền cho tổ chức dễ cắt. + Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các
miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5mm. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ từ 30 phút để rửa sạch formol.
+ Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 7 lọ cồn Cồn 80º : 1 giờ (từ 10h - 11h sáng) Cồn 90º : 2 giờ (từ 11h - 13h chiều) Cồn 95º-1 : 2 giờ (từ 13h - 15h chiều) Cồn 95º-2 : 2 giờ (từ 15h - 17h chiều)
Cồn 100º-1: Ngâm qua đêm (từ 17h chiều hôm trước - 6h sáng hôm sau) Cồn 100º-2: 1 giờ (từ 6h - 7h)
Cồn 100º-3: 1 giờ (từ 7h - 8h)
Mục đích để khử nước ra khỏi tổ chức. + Khử cồn: Cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen Xylen 1: 1 giờ (từ 8h - 9h sáng)
Xylen 2: 1 giờ (từ 9h - 10h sáng) Xylen 3: 1 giờ (từ 10h - 11h sáng)
Mục đích để khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
sáp ong đã nấu, đảo nhiều lần thành môi trường đồng nhất ổn định, đặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt), gồm 2 lọ.
Parafin 1: 2 giờ trong tủ ấm 56ºC (từ 11h - 13h chiều) Parafin 2: 2 giờ trong tủ ấm 56ºC (từ 13h - 15h chiều)
Mục đích để khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng tổ chức sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt. - Đúc block
Mục đích: Đưa bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin. Phương pháp tiến hành:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Sau đó, đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đông cứng, đặc chắc là được.
- Cắt tiêu bản:
Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 - 52ºC, phiến kính, pank kẹp… Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với độ dày khoảng 2 - 3µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Làm tiêu bản: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52ºC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm 37ºC đến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE.
- Nhuộm tiêu bản: Bao gồm các bước sau: Bước 1: Khử parafin:
Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 cốc Xylen 1: 5 phút
Xylen 2: 5 phút Xylen 3: 5 phút
Bước 2: Khử xylen:
Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc Cồn 100ºC: 5 phút
Cồn 100ºC: 5 phút Cồn 90ºC : 5 phút Cồn 70ºC : 5 phút Bước 3: Khử cồn:
Rửa nước: Cho dưới vòi nước chảy 5 phút sau đó ngâm qua bình nước cất 5 phút.
Lau khô từng tiêu bản xếp ngửa lên giá để chuẩn bị nhuộm Bước 4: Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân):
Dùng ống hút hematoxylin nhỏ lên từng tiêu bản đảm thuốc nhuộm phải ngập hết phần tổ chức của tiêu bản.
Thời gian nhuộm Hematoxylin từ 5 - 10 phút thay đổi tùy theo thuốc nhuộm mỗi lần pha và tổ chức đem nhuộm, vì vậy trong mỗi đợt nhuộm phải nhuộm thử với một tiêu bản trước rồi áp dụng cho tất cả các tiêu bản còn lại.
Soi trên kính hiển vi xem tiêu bản đã bắt màu hematoxylin chưa (nhân tế bào bắt màu xanh rõ ràng). Nếu bắt màu nhạt thì tiếp tục cho nhuộm thêm thời gian nữa, khi nào được thì cho rửa nước.
Rửa nước: Rửa nước 3 phút sau đó ngâm qua bình nước cất 3 phút. Bước 5: Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 phút, tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước thường 3 phút cho hết Eosin thừa, sau đó ngâm qua bình nước cất 2 phút.
Bước 6: Qua cồn: nhúng tiêu bản nhiều lần qua các cốc cồn Cồn 90º : trong 30 giây đến 1 phút
Cồn 100º-1: trong 30 giây đến 1 phút Cồn 100º-2: trong 5 phút
Xylen 1: trong 5 phút Xylen 2: trong 5 phút
Bước 8: Gắn Lamen: Phải luôn để lam kính trong cốc xylen rồi dùng pank kẹp từng tiêu bản ra để gắn.
Trải một lớp giấy vệ sinh hoặc khăn xô sẵn trước khi gắn. Tiêu bản lấy ra trước khi gắn sẽ để trên lớp giấy hoặc khăn xô rồi thức hiện thao tác gắn. Dùng lượng keo vừa phải, nếu keo tràn ra ngoài thì dùng giấy lau quanh cho sạch.
Yêu cầu bước gắn: tiêu bản trong sáng không có bọt khí.
Bước 9: Đánh giá kết quả: soi trên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.
e, Phương pháp xử lý số liệu Các số liê ̣u thu thâ ̣p được trong quá trı̀nh điều tra, thı́ nghiê ̣m được xử lí bằng phương pháp thống kê sinh ho ̣c: sử dụng phần mềm Excel 2007 và Minitab 16.