Phần 3 Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Các giống ngô
Các giống ngô: HN88, ADI602, NK4300, LVN5885, LVN255, LVN4 dùng để điều tra theo dõi ngoài đồng ruộng, tiến hành thử nghiệm lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới và thử nghiệm thuốc trên đồng ruộng.
3.2.2. Các hoá chất và các nguyên vật liệu khác dùng trong thí nghiệm
Cồn 960, agar, khoai tây, giấy quỳ, kiềm, axit, đường glucose, đường
saccarose,…
3.2.3. Thuốc trừ nấm
STT Tên thương mại Hoạt chất Công ty sản xuất 1 Daconil 75WP Chlorothalonil (min 98%) Công ty TNHH Việt Thắng 2 Score 250EC Difenoconazole (min 96%) Syngenta Vietnam Ltd 3 Valivithaco 5SL Validamycin A (min 40%) Cơng ty TNHH Việt Thắng
3.2.4. Đất thí nghiệm
Đất được khử trùng trước khi đem trồng ngô trong nhà lưới. 3.3. DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, panh, kéo, thước đo, bút dạ, đũa thuỷ tinh, lam, lamen, chổi lơng, kính hiển vi, kính soi nổi, nồi hấp, tủ sấy, buồng cấy, bình phun, cọc thẻ, giấy thấm, vải lọc, buồng đếm, ….
3.4. CÁC MÔI TRƯỜNG NHÂN TẠO ĐỂ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP NẤM B. MAYDIS NẤM B. MAYDIS
3.4.1. Môi trường WA (Nước - Aga)
3.4.2. Môi trường PSA (Khoai tây - đường saccarose - aga) 3.4.3. Môi trường PCA (Khoai tây - carot – aga) 3.4.3. Môi trường PCA (Khoai tây - carot – aga)
3.5. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.5.1. Địa điểm 3.5.1. Địa điểm
- Phịng thí nghiệm bộ mơn Bệnh cây - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. - Viện Bảo vệ thực vật.
- Các xã trồng ngô: Vân Côn, Tiền n, Đơng La, huyện Hồi Đức, TP Hà Nội. 3.5.2. Thời gian nghiên cứu: Tháng 01 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017.
3.6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.6.1. Điều tra thành phần bệnh hại và mức độ phổ biến trên một số giống ngô trồng tại địa phương trồng tại địa phương
3.6.2. Điều tra ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái và tập quán canh tác đến tình hình phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh đốm lá nhỏ hại ngô năm 2016 tại hình phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh đốm lá nhỏ hại ngơ năm 2016 tại huyện Hồi Đức
3.6.3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, ni cấy và gây bệnh nhân tạo của nấm B. maydis nấm B. maydis
3.6.4. Khảo sát hiệu lực của một số thuốc đối với nấm B. maydis và đối với bệnh đốm lá nhỏ ngô trên đồng ruộng đốm lá nhỏ ngô trên đồng ruộng
3.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.7.1. Phương pháp điều tra và thu thập mẫu 3.7.1. Phương pháp điều tra và thu thập mẫu
3.7.1.1. Điều tra thành phần và diễn biến bệnh hại
- Điều tra theo quy chuẩn kĩ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây ngô QCVN 01- 167 : 2014/BNNPTNT.
- Điều tra định kỳ: 7 ngày/lần, trong khu vực điều tra cố định ngay từ đầu vụ. Mỗi yếu tố điều tra 10 điểm ngẫu nhiên hoặc phân bố ngẫu nhiên trên đường chéo của khu vực điều tra. Điểm điều tra phải cách bờ ít nhất 2 mét. Mỗi điểm chọn 10 lá ngẫu nhiên (lá non, lá bánh tẻ, lá già), đếm số lá bị bệnh và phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp: Cấp 1: < 1 % diện tích lá bị bệnh; Cấp 3: từ 1 – 5 % diện tích lá bị bệnh; Cấp 5: > 5 – 25 % diện tích lá bị bệnh; Cấp 7: > 25 – 50 % diện tích lá bị bệnh; Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh.
- Quan sát triệu chứng điển hình của bệnh, đánh giá mức độ phổ biến của bệnh: Mức độ phổ biến của bệnh:
+ : Bệnh ít phổ biến (TLB < 5%); ++ : Bệnh khá phổ biến (TLB 5 - 10%); +++ : Bệnh phổ biến (TLB > 10%).
- Ruộng điều tra: Mỗi yếu tố điều tra lấy 3 ruộng đại diện. Điều tra ảnh hưởng của giống (NK4300, HN88, ADI602), đất đai (vùng bãi Vân Côn; Tiền Yên; Đông La) và chế độ luân canh cây trồng (Ngô - Lúa - cà chua; Lúa - ngô - Cải bắp; Lúa - ngơ), sử dụng phân bón (đạm Ure liều lượng 6kg/sào; 10kg/sào; 14kg/sào), mật độ (4500 cây/sào, 3600 cây/sào, 3000 cây/sào), trồng xen, thời vụ đến bệnh đốm lá nhỏ ngô.
Các chỉ tiêu cần theo dõi
Tổng lá bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng lá điều tra - Chỉ số bệnh (%) = Nxn Nnxn x N x N x N1 1) ( 3 3) ( 5 5) ..( ) ( x 100 Trong đó: N1 là (lá) bị bệnh ở cấp 1 ; N3 là (lá) bị bệnh ở cấp 3 ; Nn là (lá) bị bệnh ở cấp n ; N là tổng số (lá) điều tra ; n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9).
3.7.1.2. Phương pháp thu thập mẫu bệnh:
Chọn ruộng ngơ trong vùng điều tra có cây bị bệnh đốm lá, thu thập những cây có triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá nhỏ. Tất cả các mẫu thu thập đều ghi rõ tên cây trồng, ngày điều tra và địa điểm thu thập mẫu.
3.7.2. Phương pháp làm môi trường để nuôi cấy nấm. 3.7.2.1. Môi trường Potato glucose agar (PGA) 3.7.2.1. Môi trường Potato glucose agar (PGA)
Thành phần: Khoai tây: 200g; Agar : 20g;
Đường glucose : 20g; Nước cất : 1 lít.
Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đủ 1 lít đem đun sôi lại.
Cho lần lượt Agar, đường khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ mơi trường vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp Petri đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1800C trong vịng 2 giờ ). Sau đó đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (1210C) trong 30 phút.
3.7.2.2. Môi trường Potato carrot agar ( PCA ) Thành phần: Khoai tây: 100g; Cà rốt : 100g; Agar : 20g; Nước cất : 1 lít.
Khoai tây, cà rốt gọt vỏ sạch, thái lát mỏng đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đủ 1 lít đun sơi và cho agar khuấy cho tan hết, sau đó đổ ra bình tam giác và khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (121°C) trong 30 phút.
3.7.2.3. Môi trường PSA (Potato – Sugar – Agar) Thành phần: + Khoai tây: 200g;
+ Saccarose (đường ăn): 20g;
+ Agar: 20g;
+ Nước cất: 1000ml.
Cách làm: 200g khoai tây gọt sạch vỏ, cắt lát mỏng, luộc nhừ với 1 lít nước, sau đó lọc qua 4 lớp vải màn lấy nước trong. Cho nước khoai tây, đường ăn và agar vào xoong rồi khuấy đều. Cho xoong lên bếp, vừa đun vừa khuấy đều tay cho sôi đều rồi đổ vào chai thủy tinh, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng và đậy nắp lại, khi mơi trường nguội thì cấy nấm vào mơi trường. Nếu chưa dùng ngay thì cuốn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch, buộc miệng túi lại bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tử để sử dụng dần trong 2 – 3 ngày sau.
3.7.2.4. Môi trường Water agar (WA) Thành phần: Agar : 20g Nước cất: 1 lít
Cách pha mơi trường agar nước : Cho 20g agar vào 1 lít nước cất đun sơi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm trong thời gian 15 phút sau đó cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15ml.
3.7.3. Phương pháp phân lập nấm
Mẫu bệnh được lấy từ ngoài đồng về rửa sạch bằng nước cất, đặt mẫu trong hộp petri có giấy lọc ẩm. Đặt mẫu lá ở nhiệt độ khoảng 27°C dưới ánh sáng để thúc đẩy việc tạo bào tử. Kiểm tra sau 1 - 2 ngày dưới kính lúp soi nổi để tìm bào tử sau đó dùng kim thuỷ tinh vuốt nhọn đã vơ trùng khêu lấy bào tử cấy chuyển bào tử vào đĩa môi trường WA.
3.7.4. Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng, phát triển của nấm trên môi trường nuôi cấy và khả năng lây bệnh nhân tạo của nấm B. maydis nuôi cấy và khả năng lây bệnh nhân tạo của nấm B. maydis
3.7.4.1. Chuẩn bị nguồn nấm
Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào đĩa petri chứa môi trường PSA (cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa) sau 4 - 6 ngày dùng đĩa đó để làm nguồn cấy nấm. 3.7.4.2. Cấy nấm lên các môi trường khác nhau
Từ nguồn nấm thuần đã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung đột trịn có đường kính 5 mm đột nấm ở đĩa theo đường trịn đồng tâm sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường đã chuẩn bị (mỗi đĩa cấy 1 khoanh ở chính giữa đĩa petri, mỗi mơi trường cấy 3 đĩa.). Đo đường kính của tản nấm sau 2, 3, 4, 5 ngày, đo gián tiếp ở phía ngồi đĩa petri, không mở hộp, đo 2 lần theo chiều vng góc đĩa qua tâm của đĩa theo hình dấu cộng (+).
a. Cấy nấm lên môi trường PSA để ở các nhiệt độ khác nhau
Đo đường kính của tản nấm sau 3, 5, 7 ngày trong đĩa để tủ định ôn với nhiệt độ từ 10, 20, 30, 40°C.
b. Khả năng nảy mầm của bào tử
Sau khi cấy nấm 7 ngày trên môi trường PSA, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt đĩa petri bằng chổi lơng vơ trùng và nước cất. Để khơ sau đó đặt đĩa vào trong tủ để 12 giờ sáng, 12 giờ tối để nấm sinh bào tử. Sau đó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt
dung dịch bào tử nhỏ lên lam đậy lamen lại đưa lên kính hiển vi quan sát. Kiểm tra mật độ bằng buồng đếm hồng cầu. Dùng pipet hút 1 ml trang đều trên mơi trường WA. Để trong điều kiện phịng thí nghiệm. Đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm: Mầm dài bằng 2/3 độ dài bào tử thì được tính là nảy mầm (Plant Phytopathology).
- Chỉ tiêu theo dõi: số bào tử nảy mầm sau 0.25 h; 0.5 h; 1.0 h; 1.5 h; 2.0 h và 2.5 h.
- Chỉ tiêu kích thước bào tử nấm: dùng thước đo kính hiển vi quang học, thước có 10 vạch lớn, mỗi vạch lớn có 10 vạch nhỏ như vậy tổng có 100 vạch nhỏ. Đo ở vật kính 10X. Đếm số vạch rồi nhân lên với 10 là ra kích thước cần đo. 3.7.4.3. Thử nghiệm hiệu lực ức chế của thuốc đối với sự phát triển của nấm B. maydis trên môi trường nhân tạo
CT1: Thuốc Daconil 75WP nồng độ 0.01%; CT2: Thuốc Score 250EC nồng độ 0.01%; CT 3: Valivithaco 5SL nồng độ 0.01%; CT4: Đối chứng (dùng nước cất vô trùng). Cách pha thuốc:
+ Dùng bơm tiêm hút 1 ml thuốc hịa vào 9 ml nước vơ trùng được dung dịch A; + Lấy 1 ml dung dịch A hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch B; + Lấy 1 ml dung dịch B hịa và 99 ml mơi trường được nồng độ 0,01%. Lắc cho thuốc hòa đều vào môi trường.
Tiến hành nhắc lại 3 lần với mỗi cơng thức. Quan sát đường kính tản nấm phát triển ở các công thức khác nhau và đưa ra kết luận.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm trong 1, 2, 3, 4, 5 ngày sau cấy của các công thức.
Hiệu lực ức chế thuốc trong phịng thí nghiệm được tính theo cơng thức Abbott: C - T
HLĐK (%) = ----------- x 100 C
Trong đó:
C: đường kính tản nấm ở cơng thức đối chứng ; T: đường kính tản nấm ở cơng thức có xử lý thuốc.
3.7.4.4. Lây bệnh nhân tạo bệnh đốm lá nhỏ trong nhà lưới Các cơng thức dùng trong thí nghiệm này là:
CT1: Lây bệnh không sát thương bằng bào tử;
CT2: Lây bệnh không sát thương bằng sợi nấm (ép thạch);
CT3: Lây bệnh không sát thương bằng tàn dư bệnh (ép vết bệnh).
a. Chuẩn bị cây trồng
Sử dụng giống ngơ HN88 trồng trên 18 chậu có chứa đất đã được hấp tiệt trùng và lây nhiễm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn 5 - 7 lá. Mỗi chậu trồng 5 cây. Mỗi lá lây 1 điểm. Tổng số lá lây là 30 lá/1 lần nhắc lại.
b. Lây nhiễm bằng bào tử
Lấy nấm từ ống nghiệm lưu giữ nguồn đã phân lập cấy lên đĩa petri chứa môi trường PSA, sau 10 ngày lúc này sợi nấm sẽ mọc kín mơi trường.
Lấy đĩa nấm ra dùng bình tia phun nước cất vào, dùng chổi lông quét đi, quét lại nhiều lần trên bề mặt đĩa, dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước quét khô mặt thạch (rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
Đặt đĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 1 ngày để bào tử hình thành. Dùng 20ml nước vơ trùng có pha Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho một đĩa petri. Lấy 1 giọt dung dịch bào tử đã rửa ở trên nhỏ lên lam kính soi dưới kính hiển vi. Đếm số bào tử trên quang trường 10X. Điều chỉnh dung dịch bào tử sao cho có khoảng 30 - 50 bào tử trên quang trường tương đương với 105 bào tử/ml. (đếm 5 quang trường 10X).
Dùng bút dạ dầu đánh dấu điểm lây. Sử dụng bình phun cầm tay loại dung tích 0,5 lít để phun dung dịch lên phần lá ngơ đã đánh dấu. Sau đó phun và giữ ẩm liên tục trong 20 giờ (ẩm trên 90%), sau đó đem ngơ đặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới nước đầy đủ để ngô vẫn tiếp tục phát triển.
c. Lây bệnh bằng ép thạch
Dùng đĩa nấm đã có sợi nấm mọc kín trên mơi trường PSA sau khi cấy chuyển nguồn 10 ngày. Cắt miếng thạch khoảng 1mm3 và ép lên mặt trên của lá.
d. Lây nhiễm bằng ép lá
Dùng lá có triệu chứng bệnh đốm lá nhỏ đặc trưng, kiểm tra bào tử trên kính soi nổi. Sau đó dùng vết bệnh áp lên mặt trên của lá ngô. Theo dõi đếm số lá xuất hiện vết bệnh.
e. Đánh giá
Quan sát thời gian (ngày) kể từ khi lây nhiễm tới khi xuất hiện vết bệnh sau 5, 10, 15, 20 ngày lây bệnh.
Tiến hành thí nghiệm và nhắc lại 3 lần. Từ đó nhận xét về khả năng lây bệnh của nấm gây bệnh.
3.7.4.5. Khả năng kháng nhiễm bệnh đốm lá nhỏ ngô của một số giống ngô trong nhà lưới
Thực hiện lây bệnh không sát thương bằng bào tử. Mỗi công thức lây 30 lá. Các cơng thức dùng trong thí nghiệm này là:
CT1: Giống LVN255; CT2: Giống LVN5885; CT3: Giống HN88; CT4: Giống LVN4.
Sử dụng giống ngô kháng bệnh đốm lá nhỏ (LVN255, LVN5885) và giống trồng phổ biến tại địa phương (HN88, LVN4) được trồng trong các chậu có chứa đất tiệt trùng. Hai mươi bốn (24) chậu được lây nhiễm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn 5 - 7 lá. Mỗi chậu trồng 5 cây. Quan sát cấp bệnh, tỷ lệ bệnh. Đánh giá toàn bộ số lá lây nhiễm.
Áp dụng theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-56:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống ngô
Mức độ biểu hiện Điểm
Không bị bệnh 0 Rất nhẹ (1 - 10%) 1 Nhiễm nhẹ (11 - 25%) 2 Nhiễm vừa ( 26 - 50%) 3 Nhiễm nặng (51 - 75%) 4 Nhiễm rất nặng >75%) 5
Chỉ tiêu theo dõi: Cấp bệnh, TLB (%).
3.7.5. Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh đốm lá nhỏ ngoài đồng ruộng Pha thuốc BVTV theo hướng dẫn ghi trên nhãn mác. Pha thuốc BVTV theo hướng dẫn ghi trên nhãn mác.
Công thức 1: Daconil 75WP, 1,2kg/ha; Cơng thức 2: Score 250EC, 0,4 lít/ha;
Cơng thức 3: Valivithaco 5SL, 0,9 lít/ha;
Cơng thức 4: Đối chứng (khơng phun thuốc, phun nước lã).
Tiến hành nhắc lại 3 lần với mỗi công thức. Mỗi lần nhắc lại 50m2. Quan sát số lá bị bệnh và đưa ra kết luận.
Chỉ tiêu theo dõi: TLB, CSB trước phun 1 ngày, sau phun 3, 7, 10 ngày Hiệu lực phịng trừ của thuốc BVTV bằng cơng thức Henderson – Tilton
Ta x Cb
H (%) = 1 - ----------- x 100 Tb x Ca
Trong đó:
H: Hiệu lực của thuốc ;
Ta: Tỷ lệ bệnh ở công thức xử lý thuốc sau khi thí nghiệm ; Tb : Tỷ lệ bệnh ở cơng thức xử lý thuốc trước khi thí nghiệm ; Ca: Tỷ lệ bệnh ở cơng thức đối chứng sau khi thí nghiệm ; Cb : Tỷ lệ bệnh ở cơng thức đối chứng trước khi thí nghiệm. 3.7.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm IRRISTART 4.0 và chương trình Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. THÀNH PHẦN BỆNH CHÍNH HẠI NGƠ TẠI XÃ ĐƠNG LA, HUYỆN HỒI ĐỨC, THÀNH PHỐ HÀ NỘI HỒI ĐỨC, THÀNH PHỐ HÀ NỘI
Trên cây ngơ có rất nhiều lồi nấm gây hại khác nhau, để khảo sát thành phần, mức độ phổ biến của các bệnh do nấm gây ra trên ngô, chúng tôi tiến hành