Vi sinh vật trong ruột mối có tới 99% là không nuôi cấy được. Do đó để phân lập được gen từ các vi sinh vật này, đặc biệt là các gen từ vi khuẩn, chúng tôi đã sử dụng phương pháp mới đó là kỹ thuật metagenomics. Phương pháp này cho phép tách metagenome của hệ vi sinh vật trực tiếp từ môi trường sống của nó mà không thông qua nuôi cấy, do đó sẽ giảm thiểu được sự mất mát nguồn gen quý trong quá trình thu mẫu. Tuy nhiên, do tính không đồng nhất của tập hợp các tế bào vi sinh vật từ mẫu môi trường (cấu trúc tế bào của các loài vi sinh vật khác nhau, nằm ở các pha sinh trưởng khác nhau), nên không có một phương pháp chung nào hiệu quả cho việc tách metagenome từ mọi loại môi trường. Hơn nữa, mẫu metagenome thường bị lẫn nhiều tạp chất từ vật chủ và môi trường sống, ảnh hưởng tới chất lượng mẫu DNA metagenome để chạy trình tự và quá trình phân tích số liệu metagenome [51]. Do vậy, việc khảo sát các điều kiện để tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối để thu được DNA metagenome có chất lượng tốt và nồng độ cao, đạt đủ điều kiện để đi giải trình tự là rất quan trọng.
DNA metagenome hệ vi sinh vật có thể được thu nhận 1) trong quá trình phá vỡ tế bào vi sinh vật sau khi đã được thu trực tiếp từ môi trường hoặc 2) phá vỡ tế bào ngay trong môi trường của nó (ruột mối, trong trường hợp này). Phương pháp thứ hai thường được sử dụng hơn vì nó cho phép thu được lượng DNA nhiều hơn, nhưng đồng thời kèm theo DNA thì lượng tạp chất thu được cũng lớn hơn, tức là độ sạch của DNA metagenome kém hơn [49]. Các tạp chất có trong mẫu DNA metagenome đa phần là axít humic, thường rất khó loại bỏ khỏi metagenome trong quá trình tách chiết. Nó có cấu trúc lý hóa tương đồng với axít nucleic, do đó luôn cản trở quá trình phân tích DNA và ức chế các phản ứng enzym xúc tác [27, 49]. Ngoài ra, axít humic còn có khả năng hoạt hóa các nuclease cắt nhỏ DNA metagenome, gây khó khăn trong việc bảo quản kích thước nguyên vẹn của DNA metagenome. Do vậy, để thu được DNA metagenome với kích thước nguyên vẹn và độ sạch cao, đạt chất lượng để giải trình tự toàn bộ, sau khi thu nhận tế bào vi sinh vật từ ruột mối, chúng tôi mới tiến hành tách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chiết DNA metagenome vi khuẩn (theo phương pháp thứ nhất). Ruột mối được chà nhẹ trong đệm PBS và lọc qua rây. Thao tác cơ học này làm cho ruột mối bung ra để giải phóng tế bào vi sinh vật, nhưng không đủ mạnh để phá vỡ cả tế bào ruột mối. Tiếp đến, tế bào ruột mối được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm phân đoạn, còn các tế bào vi sinh vật ở pha trên được giữ lại và rửa nhiều lần bằng đệm PBS để loại bỏ bớt các tạp chất lẫn trong mẫu môi trường. Sau đó, DNA metagenome của vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Sambrook [70]. Đây là phương pháp tách chiết genome vi khuẩn, chỉ sử dụng các enzym phá vỡ thành tế bào vi khuẩn nên các tế bào nhân thật còn sót lại sẽ không bị vỡ và sẽ được loại bỏ trong bước ly tâm. Với quy trình tách chiết này, DNA metagenome của vi khuẩn trong ruột mối đã được tách chiết thành công, có kích thước cao hơn băng DNA 10 kb (kilobase, bằng 1000 bp) của thang DNA chuẩn (Hình 3.3).
Tuy nhiên, DNA metagenome còn lẫn một số băng RNA khác không mong muốn và các tạp chất khác. Các chất lẫn tạp cũng như các RNA không mong muốn này đã được loại bỏ khỏi DNA metagenome bằng phương pháp troughing [26]. Đây là một phương pháp tinh sạch đơn giản và hiệu quả, cho phép thu lại tới hơn 70% DNA genome và loại bỏ hiệu quả các tạp chất, đặc biệt là axít humic. Kết quả là DNA metagenome sau tinh sạch không còn bị lẫn tạp chất và RNA nữa (Hình 3.4).
Hình 3.3:Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật ruột mối.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối tách chiết bằng phương pháp này kết hợp với tinh sạch bằng phương pháp troughing rất ổn định, với kích thước nguyên vẹn với lượng DNA thu hồi được nhiều hơn so với khi tinh sạch bằng kít Qiagen. (Hình 3.5). Sản phẩm DNA metagenome được tinh sạch bằng phương pháp troughing vẫn giữ được kích thước nguyên vẹn sau 3 tháng cất giữ ở -20o
C, không bị phân cắt thành một dải như ở mẫu DNA metagenome được tinh sạch bằng kít Qiagen (Hình 3.6). Trong khi đó, DNA metagenome tinh sạch bằng phương pháp troughing có độ sạch cao, tương đương như khi tinh sạch bằng kít (A260/A280 trong khoảng 1,86 đến 1,9) [3]. Điều đó chứng tỏ troughing là một phương pháp tinh sạch rất hữu hiệu, có thể loại bỏ hiệu quả các chất lẫn tạp, đặc biệt là axít humic ra ra khỏi mẫu DNA metagenome, trong khi kít tinh sạch (Qiagen) không thể loại bỏ hoàn toàn được axít humic ra khỏi mẫu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối.
M DNAmet
Hình 3.4: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối sau tinh sạch bằng phƣơng pháp troughing. Băng DNA metagenome thu được
sạch và có kích thước nguyên vẹn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.5: Ảnh điện di lƣợng DNA metagenome thu đƣợc sau tinh sạch bằng phƣơng pháp troughing (đƣờng chạy 2) và bằng kít (đƣờng chạy 3). Đường chạy 1 là DNA metagenome trước tinh sạch.
Từ một triệu mẫu ruột mối, chúng tôi đã tách chiết và tinh sạch được 75 μl dịch DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối, nồng độ 114 ng/μl (tương đương với 8,5 μg) có chất lượng tốt, với độ sạch cao (A260/A280 bằng 1,81) và kích thước cao (gần 23 kb) (Hình 3.7). Mẫu metagenome sau đó đã được gửi đi giải trình tự toàn bộ bằng hệ thống máy giải trình tự Illumina’s HiSeq (BGI, Trung Quốc).
Hình 3.7: Ảnh điện di mẫu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối gửi đi giải trình tự. DNA metagenome sạch và có kích thước lớn.
DNAmet M
M 1 2
Hình 3.6: Ảnh điện di kiểm tra độ ổn định của DNA metagenome đƣợc tinh sạch bằng kít (đƣờng chạy 1) và phƣơng pháp troughing (đƣờng chạy 2).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/