Trong nguyên vật liệu lignocellulose như rơm rạ, cellulose và hemicellulose chiếm khoảng 70% và là nguồn cơ chất chủ yếu cho quá trình sản xuất cồn sinh học thế hệ thứ hai. Do có cấu trúc phức tạp, quá trình sản xuất cồn sinh học từ lignocellulose đòi hỏi ít nhất bốn công đoạn là 1) tiền xử lý để phá vỡ cấu trúc lignin, giải phóng cellulose và hemicellulose; 2) thủy phân cellulose và hemicellulose bằng enzym cellulase và hemicellulase để tạo đường đơn; 3) lên men tạo sản phẩm và 4) chưng cất sản phẩm (Hình 1.6) [22].
Hình 1.6: Quy trình sản xuất cồn sinh học từ nguyên vật liệu lignocelluloses [91].
1.2.2.1. Các enzym tham gia tiền xử lý
Phân hủy lignin là bước đầu tiên trong quá trình thủy phân lignocellulose, tạo điều kiện cho các enzym cellulase và hemicellulase tiếp cận và thủy phân các chuỗi cellulose và hemicellulose thành đường đơn [71]. Để phá vỡ cấu trúc của lignin, thông thường người ta sử dụng cả hai biện pháp cơ học (cắt và nghiền nhỏ, xử lý ở nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cao) và hóa học (xử lý với axít hoặc kiềm). Biện pháp cơ học thì cần nhiều nhiên liệu tạo nhiệt [25], còn xử lý hóa học thì tạo ra các chất ức chế enzym tham gia thủy phân ở công đoạn sau. Vì vậy, sau khi xử lý, axít và kiềm cần phải được loại bỏ hoàn toàn khỏi cellulose và hemicellulose. Đây là việc làm không dễ dàng và gây ô nhiễm môi trường.
Gần đây, các nhà nghiên cứu tìm thấy được một số chủng vi sinh vật, chủ yếu là nấm sợi và nấm mục có khả năng sản xuất enzym phân hủy lignin, gọi chung là ligninase. Các enzym này được chia làm hai họ 1) phenol oxidase (laccase) và 2)
peroxidase, gồm có lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và
peroxidise đa năng [47]. Kết quả từ một số nghiên cứu cho thấy, một số nấm mục trắng
như Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium và Trametes versicolor là
những vi sinh vật phân hủy lignin hiệu quả nhất [16]. Tiền xử lý lignocellulose bằng các chủng vi sinh vật có khả năng phá vỡ cấu trúc lignin (phương pháp sinh học) có nhiều ưu thế, như nhu cầu năng lượng thấp, giảm thiểu chất thải trong quá trình xử lý và không ảnh hưởng tới môi trường. P. chrysosporium có khả năng tấn công không
chọn lọc vào cả lignin và carbohydrate, do đó chúng đã được sử dụng thành công trong quá trình tiền xử lý thân cây bông [73]. Ceriporiopsis subvermispora có khả năng sản xuất ra manganase peroxide và laccase, do đó có thể loại bỏ lignin một cách chọn lọc từ các loài cây gỗ [18].
Cellulose và hemicellulose sau khi được phân tách ra khỏi cấu trúc lignocellulose rắn chắc ban đầu trong quá trình tiền xử lý sẽ được thủy phân thành các phân tử đường đơn, là nguyên liệu cho quá trình lên men. Phương pháp hữu hiệu nhất để thủy phân các polysaccharide này là sử dụng các enzym đặc hiệu, cụ thể là cellulase và hemicellulase.
1.2.2.2. Enzym hemicellulase
Hemicellulase là enzym thủy phân hemicellulose, đóng một vai trò rất quan trọng trong phân hủy sinh khối thực vật và chu trình carbon trong tự nhiên. Hemicellulase thường được phân chia thành các nhóm như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
a. Nhóm xylanase: thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với nhau, giải
phóng các phân tử ngắn xylooligomer, gồm có endo-xylanase, exo-xylanase, beta-
xylosidase, acetyl xylan esterase, feruloyl esterase, glucuronoyl esterase. Endo-
xylanase có khả năng cắt liên kết β-1,4-xylose trong mạch xylan; exo-xylanase thủy phân liên kết β-1,4-xylose của các đầu tự do, giải phóng ra xylobiose; còn beta-xylosidase có khả năng thủy phân xylobiose thành đường đơn xylose [71, 72] (Hình 1.7).
Hình 1.7: Một số enzym hemicellulase tham gia vào quá trình phân hủy hemicellulose [66].
b. Nhóm β-mannanase: enzym β-mannanase tham gia thủy phân galacto-
glucomannan và giải phóng các tiểu phần β-1,4-manno-oligomers. Sau đó các tiểu phần này có thể bị thủy phân thành các đơn phân mannose bởi enzym β-
mannosidase [31].
c. Nhóm α-L-arabinofuranosidase: enzym α-L-arabinofuranosidase tham gia thủy
phân nhánh bên của phân tử xylan và giải phóng các phân tử α-1,5-L-arabinan. Sau
đó α-L-arabinanase tiếp tục thủy phân α-1,5-L-arabinan thành các phân tử nhỏ hơn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
d. Nhóm α-D-glucuronidase: enzym α-D-glucuronidase cắt các cầu nối α-1,2-
glycosidic của phân tử 4-O-methyl-D-glucuronic ở nhánh bên của phân tử xylan [55].
e. Các enzym khác: điển hình như glucanase, xyloglucan hydrolase và pectinase
cũng tham gia nhiều vào quá trình phân giải hemicellulose [75].
Do có thành phần phức tạp nên quá trình phân hủy hemicellulose đòi hỏi sự tham gia của nhiều loại enzym và phụ thuộc vào thành phần hemicellulose của cơ chất. Ví dụ, sự thủy phân xylan có mặt trong gỗ cứng cần có sự tham gia của enzym các nhóm xylanase. Trong khi đó, sự thủy phân glucomannan trong thành phần gỗ mềm lại cần có sự tham gia xúc tác của các enzym nhóm β-mannanase [44].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sự phá hủy các chuỗi hemicellulose là điều kiện cần thiết cho phép các enzym cellulase tiếp cận tối đa với cellulose, diễn ra quá trình thủy phân cellulose để tạo đường đơn glucose. Cellulase là enzym thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất
polysaccharide và
oligosaccharide được tìm
thấy trong tự nhiên
(cellulose, tinh bột, chitin,
xylan, laminarin và
cellobiose). Để thủy phân
cellulose thành glucose hoàn
toàn, cần có ba họ enzym khác
nhau: 1) endoglucanase (endo- -1,4-glucanase hay endo-1,4- -D-glucan-4- glucanohydrolase; EGs, EC 3.2.1.4), tác động vào những vùng không định hình, không bị tinh thể hóa của sợi cellulose và cắt ngẫu nhiên các liên kết trong chuỗi cellulose tạo thành các mạch oligosaccharide hòa tan có các đầu tự do; 2) exoglucanase hay cellobiohydrolase (1,4- -D-glucan cellobiohydrolase; CBHs, EC 3.2.1.91), tiếp tục phân cắt các chuỗi oligosaccharide từ các đầu tự do, tạo thành các phân tử đường đôi cellobiose; 3) -glucosidase ( -D-glucoside glucohydrolase; BGs, EC 3.2.1.21) phân cắt các liên kết của cellobiose và oligosaccharide thành đường glucose, là nguyên liệu cho quá trình lên men (Hình 1.8) [86].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 1.8: Các họ enzym cellulose tham gia vào quá trình thủy phân sợi cellulose [66].
Trong tự nhiên, enzym endoglucanase phổ biến hơn exoglucanase. Endoglucanase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật, trong khi exoglucanase chỉ xuất hiện giới hạn ở vi khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh. β-glucosidase cũng là một dạng enzym cellulase phổ biến. Một số enzym đã được tìm ra có hoạt tính của cả hai loại endoglucanase và exoglucanase [69]. Phần lớn các sinh vật tạo ra cellulase, thường chỉ bao gồm endoglucanase và β-glucanase, do đó chỉ có thể thủy phân cellulose đến một mức độ nhất định và chúng được gọi là các cellulase “không hoàn thành”. Tuy nhiên, chúng vẫn rất cần thiết để tạo ra một lượng đường lớn cho vật chủ. Ở mối, các cellulase nội sinh cũng thuộc thể loại này. Ở một số loài nấm và vi khuẩn như nấm trắng, nấm thối nâu, Clostridium và vi khuẩn ruột dạ cỏ, quá trình thủy phân cellulose diễn ra hiệu quả bởi enzym của chính cơ thể chủ và người ta gọi đó là các cellulase “hoàn thành”.