2.2.3.1. Thu tế bào vi khuẩn từ ruột mối
Cứ 300 ruột mối (trọng lượng khoảng 0,15 g) thì được chuyển lên rây và được chà nhẹ bằng thìa cân nhỏ đã khử trùng, sao cho ruột mối bung ra. Tất cả dịch có chứa vi sinh vật lọt qua rây được thu lại vào ống falcon 50 ml. Ruột mối sau đó được rửa nhẹ nhàng nhiều lần trong PBS và lọc qua rây để thu được tối đa các tế bào vi khuẩn. Dịch thu chứa các tế bào vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 700 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại 3 lần) để loại bỏ xác ruột mối (pha tủa). Các tế bào vi khuẩn nằm trong dịch nổi được thu lại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Để thu tế bào vi khuẩn, dịch thu được từ bước trên được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào được rửa sạch bằng cách bổ sung thêm đệm PBS vào mỗi ống tủa tế bào thu được. Làm tan tế bào rồi ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu lại vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn sau đó được làm dịch hóa trong 500 µl nước vô trùng.
2.2.3.2. Tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối
DNA metagenome của hệ vi khuẩn ruột mối được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và cộng sự [70]. Nguyên lý của phương pháp này như sau: thành tế bào vi khuẩn sau khi được phá bằng lysozyme, các protein nội bào và RNA sẽ bị cắt nhỏ bởi enzym RNase A và protease K; NaCl có tác dụng tách protein bám DNA ra khỏi hệ gen. Protein và các tạp chất sẽ bị loại bằng hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) và chloroform : isoamyl alcohol (24:1). DNA được thu lại bằng cách tủa với cồn 100%.
Tế bào vi khuẩn được hòa vào 352,5 µl TE. Bổ sung thêm 3 µl lysozyme 10 mg/ml và 3 µl RNase 10 mg/ml rồi ủ ở 37oC trong 10 phút. Tiếp tục bổ sung 6 µl protease K 20 mg/ml, 30 µl SDS 10% và ủ ở 37oC trong 30 phút. Bổ sung thêm 140 µl TE, 180 µl NaCl 5 M, đảo đều và lắc nhẹ rồi ủ ở 80oC trong vòng 15 phút.
Bổ sung vào hỗn hợp dịch trên 750 µl phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) và trộn đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi trên cùng (bước này được thực hiện hai lần). Tiếp tục bổ sung 750 µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) rồi trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi trên cùng.
Bổ sung hai lần thể tích cồn 100% vào dịch nổi thu được rồi ủ ở -80oC trong 30 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa DNA. Tiếp tục bổ sung 500 µl cồn 70% để rửa tủa. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa DNA. Làm khô DNA rồi bổ sung 10 µl dH2O để hòa tan DNA. DNA metagenome thu được sẽ chạy điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra và cất giữ ở -20o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
theo. Mẫu DNA metagenome sau khi tách chiết được tinh sạch ngay bằng phương pháp troughing để loại bỏ các tạp chất và axít humic.