Phonxay năm 2017
Lấy mẫu:
Lấy tối thiểu 2g tổ chức biểu mô của mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ và dịch mụn nước, sau đó được bảo quản trong dung dịch đệm PBS 0,04M có Glyxerin, pH từ 7,2 – 7,6, ở - 20°C.
Biểu mô và mụn nước dùng để phát hiện kháng nguyên được lấy trong vòng 7 ngày kể từ khi phát hiện bệnh.
Xử lý bệnh phẩm:
với dung dịch PBS 0,04M tỷ lệ 1:10. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 vòng/phút. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên rồi cho dung dịch kháng khuẩn vào (0,01 ml/1 ml huyễn dịch), lắc đều trong 15 đến 20 phút rồi tiến hành làm phản ứng ELISA.
Bố trí thí nghiệm:
Khay vi thể 96 giếng, được đánh số hàng ngang theo thứ tự từ 1 - 12 và theo hàng dọc từ A - H (12 cột, 8 hàng).
+ Theo hàng dọc: đĩa được chia làm 2 phần từ A - D và từ E - H tương ứng từng hàng với các serotype O, A, C, Asia1.
+ Theo hàng ngang: từ cột số1 - 4 là các đối chứng kháng nguyên (+) mạnh và các kháng nguyên (+) yếu.
(+) ma ̣nh (+) yếu Blank Mẫu 1 Mẫu 3 Mẫu 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 O 1/5 1/25 1/125 1/625 A 1/5 1/25 1/125 1/625 C 1/5 1/25 1/125 1/625 Asia1 1/5 1/25 1/125 1/625 O 1/5 1/25 1/125 1/625 A 1/5 1/25 1/125 1/625 C 1/5 1/25 1/125 1/625 Asia1 1/5 1/25 1/125 1/625
Mẫu 2 Mẫu 4 Mẫu 6
Hı̀nh 3.1. Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên tiến hành xét nghiệm
Sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện kháng nguyên virus LMLM được tiến hành theo sơ đồ sau:
Hấp thụ kháng thể thỏ virus LMLM của các serotyp O, A, C, Asia1 được pha 1:1000 với dung dịch gắn Carbonate/bicarbonate 50µl/1 giếng theo hàng phản ứng.
Ủ qua đêm ở 4°C hoặc lắc 1 giờ ở 37°C
Cho 50 µl kháng nguyên đối chứng (+) của từng type virus O, A, C, Asia1 và các huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào các hàng tương ứng đã gắn kháng thể thỏ.
Lắc, ủ 1 giờ ở 37°C Rửa 3 lần, thấm khô
Cho 50µl kháng thể chuột lang kháng virus LMLM của từng serotyp O, A, C, Asia1 vào các hàng tương ứng.
Lắc, ủ 1 giờ ở 37°C Rửa 3 lần, thấm khô Cho 50µl Conjugate đã được pha loãng vào mối giếng
Lắc, ủ 1 giờ ở 37°C Rửa 3 lần, thấm khô Cho 50µl One shot sustrate vào mỗi giếng
Để ở nhiệt độ phòng 15 phút, tránh ánh sáng Dừng phản ứng với 50µl H2SO4 1,25M
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492nm
Điều kiện chấp nhận kết quả:
Ít nhất 3 serotype đối chứng có giá trị OD trung bình sau khi đã trừ trung bình OD blank > 0.1 với cả 4 nồng độ đều có hệ số pha loãng là 5
Mỗi serotype đối chứng phải có ít nhất 3 nồng độ pha loãng bậc 5 có giá trị OD trung bình sau khi đã trừ trung bình OD blank > 0.1
Đánh giá kết quả
Mẫu được xem là dương tính khi đủ các điều kiện sau:
-Mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau khi đã trừ trung bình OD blank > 0.1
-Nếu đồng thời có nhiều serotype có gía trị OD trung bình sau khi trừ trung bình OD blank > 0.1, thì serotype được xem là dương tính khi giá trị trung bình OD của serotype đó trừ đi trung bình OD blank phải gấp đôi giá trị trung bình OD của serotype có giá trị tiếp theo trừ đi trung bình OD blank.
OD blank dừng ở 0.1 (= 0.1) thì có thể làm lại (retesting) hoặc tiến hành phân lập mẫu trên tế bào (tissus culture) và kiểm tra lại bằng ELISA.
-Nếu mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau khi đã trừ trung bình OD blank mà < 0.1 thì mẫu này được ghi nhận là âm tính với serotype tương ứng đó.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN